網膜前駆細胞の空間配置と核・細胞体移動の研究：集団協調と細胞運命選択のメカニズム

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J40113
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 田崎(齋藤) 加奈子 名古屋大学, 医学研究科, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: 神経発生 / ライブイメージング

Outline of Annual Research Achievements

網膜前駆細胞の集団において、細胞周期進行に伴って組織の丁端面(apical)と基底面（basal）間で細胞核の移動を行うINM(Interkinetic Nuclear Migration)は均質ではないと過去の自身の研究で知ったが、最近の同研究室による研究により、網膜と同じく中枢神経系である大脳において、マウスとフェレットという、異種動物間ではINMの挙動が大きく異なるという結果が、報告された（okamoto, et al 2014：共著者）。これら違いはそれぞれの組織のもつ細胞密度の違いからもたらされているのではないかと同論文で同時に予測され事より、『いったい幾通りの異なるINMのパターンがあるのか？』　という疑問より、核や組織すべての細胞膜を標識するシステム，LoxP,Creプラスミドのelectroporation法などを用いての組織内の一定数の細胞を散発的標識， 細胞周期のS期からM期を標識するシステムを組み合わせた、網膜及び大脳のスライス培養を用い、共焦点顕微鏡によるタイムラプス撮影し、トラッキングとMSD解析等を行っている。
また、このINMがヘテロである理由に答えるべく（basal突起を相続した娘細胞が早く動くと考えるが他に理由はないか？）、例えば分化度と核移動様式の関係について明らかにするため、細胞の増殖を制御するHippo経路のコアクチベーターであるYap遺伝子の活性化型のプラスミドをelectroporationする事により未分化性を維持させ、apical側で細胞密度を上昇した状態を作り出す事ができている。この状態でINM軌跡を解析するなど、分化度を変化させる事によるINMの様式の変化なども網羅的に把握し，パターンを細胞形態（basal突起の相続や新生に注目する），細胞分化度，細胞周期進行状況などとの関係に注目して分析・分類している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

神経上皮（あるいは脳室帯）という中枢神経系の起源組織がどう構造的および機能的に成立しているか問うため、「細胞の形態と近隣関係性の両方を考慮しつつ集団としての細胞挙動を問う」，「個別＋三次元＋全細胞」という新しく包括的なイメージングと組織（細胞集団）動態に関する解析をきわめて精力的に進めてきたが、実はこの問題は難題である．特定の分子を奪い去りその結果を組織単位で評価・判定するという，多くの従前研究がとってきたアプローチだけでは充分ではなく，「個」と「集団」の両方を動的にとらえた上での分析が求められる．
これまでに、当初から計画していたライブ観察結果の丹念な定量解析等により、細胞集団の動きの分子機構の一端を明らかにしつつある．さらに，細胞集団の流れが，これまで思いもしなかった力学的作用をもたらしていることもつかみつつある．こうした知見を H28年度に学会発表（日本発生生物学会，ポスター）の予定である．これらの結果に加えて，自らの観察を通じて着想した「力学的要因の関与」を新たに問うべく，具体的には、（１）吸引装置を用い、培養組織を伸張させる。（２）培養細胞ストレッチ装置を用い、スライス培養の状態で組織に圧縮を加える。（３）母体を生存させたまま、マウス胎児の脳や網膜にアガロースゲルを注入し、眼圧や脳室圧等を高くさせることにより組織を伸張させる。その状態で数日間、飼育する事も可能である。等、物理的な力を組織の外側から加える事により、細胞密度や細胞形態を変化させる事に成功している。

Strategy for Future Research Activity

２年目までに得た様々なライブイメージングの結果をもとに（ある核、細胞体の動きに対して周囲細胞からどういう力学的な負荷が与えられ、当該細胞はどうそれに応じるか？　等）、実測値及び動画で認める動きを参考にしてパラメーター設定したものもの検証を継続的に進める。それと共に、力学的な要因群（物理的な力を組織の外側から加える事により細胞密度や細胞形態を変化させる事により、能動的な成分と受動的な成分の程度を計測する　等）についての実測値を踏まえてシミュレーションの改善に取り組み、組み合わせ検証していく。．さらに、同じ動物種、組織内でも、発生の時期や領域により、多彩な相違が見られると予測される事から、主に固定組織を用い、細胞密度や形態を詳細に調べている。これらの結果を 上半期中に論文投稿し，下半期でのrevisionを経て採択を果たす．