ゼブラフィッシュの挿入変異生成法による脊椎動物遺伝子の機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15011256
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 川上 浩一 国立遺伝学研究所, 個体遺伝研究系, 助教授 (70195048)
• Keywords: 分子生物学 / 発生遺伝学 / ゼブラフィッシュ / トランスポゾン / 挿入変異 / 転移酵素 / 遺伝子トラップ / トランスジェニック動物

Research Abstract

(1)メダカトランスポゾンTol2因子を基に、スプライスアクセプター部位、リポーター遺伝子であるGFP遺伝子、SV40のポリAシグナルをも遺伝子トラップベクターを構築した。転移酵素をコードするmRNAを試験管内で合成した。この遺伝子トラップベクタープラスミドDNAを転移酵素mRNAとともに、ゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入した。
(2)微量注入を施されたゼブラフィッシュを成魚に育て、かけあわせにより次世代のゼブラフィッシュ胚を得た。それら次世代ゼブラフィッシュ胚を実体蛍光顕微鏡下で観察することにより、GFPを時空間特異的に発現する遺伝子トラップゼブラフィッシュを多数分離することができた。
(3)遺伝子トラップゼブラフィッシュのうちの1つでは、GFPが体節特異的に発現していた。この遺伝子トラップゼブラフィッシュをかけあわせることにより、単一のトランスポゾン挿入を有するゼブラフィッシュ系統を確立した。サザン解析により、体節特異的発現の原因となるトランスポゾン挿入を特定することができた。トランスポゾン挿入近傍のゲノムDNAをインバースPCR法によりクローニングし、塩基配列を決定し、トランスポゾンがhoxcクラスターに挿入されていることを明らかにした。5'RACE法によりhoxc3a遺伝子の転写がトラップされていることを明らかにした。
(4)この他に単一のトランスポゾン挿入を有する遺伝子トラップゼブラフィッシュを15系統確立し、インバースPCRによる近傍ゲノムの解析を行った。また、これらのうち7系統について5'RACE法によりトラップされている転写物を明らかにした。

Research Products

• [Publications] Terai, Y., Morikawa, N., Kawakami, K., Okada, N.: "The complexity of alternative splicing of hagoromo mRNAs is increased in an explosively speciated lineage in East African cichlids."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100. 12798-12803 (2003)
• [Publications] Clark, M.S., Edwards, Y.J.K., Peterson, D., Clifton, S.W., Thompson, A.J., Sasaki, M., Suzuki, Y., Kikuchi, K., Watabe, S., Kawakami, K., Sugano.S., Elgar, G., Johnson, S.L.: "Fugu ESTs : New resources for transcription analysis and genome annotation."Genome Research. 13. 2747-2753 (2003)
• [Publications] Kawakami, K., Noda, T.: "Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells."Genetics. 166. 895-899 (2004)