原子レベルでの病態解明に向けたハイスループットな分子間相互作用解析法の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15012213
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 嶋田 一夫 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (70196476)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂倉 正義 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (20334336)
• Keywords: NMR / 構造生物学 / 分子間相互作用 / ハイスループット / 交差飽和法

Research Abstract

転移交差飽和法は、分子量無限大の蛋白質複合体に対して、その界面残基を精密に同定する核磁気共鳴(NMR)測定法である。転移交差飽和法を膜タンパク質-ペプチドリガンド間の相互作用系に対して適用するための、最適条件(膜タンパク質の可溶化条件、膜タンパク質-ペプチドモル比、化学交換速度、溶媒の軽水/重水率、飽和方法・飽和時間、等)の探索を行なった。題材としては、Streptomyces lividans由来のカリウムチャネルKcsAとカリウムチャネル阻害ペプチドAgitoxin2を用いた。カリウムチャネルKcsAとカリウムチャネル阻害ペプチドAgitoxin2の発現には大腸菌による大量発現系をもちいた。また、NMR測定に用いるAgitoxin2は、最小培地により、15Nおよび重水素で均一標識をおこなった。
さらに、(転移)交差飽和法をタンパク質-糖鎖間相互作用系、タンパク質-核酸間相互作用系に対して適用するための、最適条件(タンパク質-リガンドモル比、化学交換速度、溶媒の軽水/重水率、飽和方法・飽和時間、等)の探索を行なった。題材としては、CD44細胞外ドメインとヒアルロン酸(2糖の繰り返しからなる多糖)(タンパク質-糖鎖間相互作用系)、インテインとその認識DNA配列(タンパク質-核酸間相互作用系)を用いた。ヒアルロン酸は、不均一高分子多量体であるので、酵素により重合度のそろった分子を得る方法の確立を目指した。

Research Products

• [Publications] Noritaka Nishida: "Novel Collagen-Binding Mode of the VWA Domain Determined by a Transferred Cross-Saturation Experiment"Nature Struct.Biol.. 10. 53-58 (2003)
• [Publications] Yoshimasa Kyogoku: "Structural Genomics of Membrane Proteins"Accounts.Chem.Res. 36. 199-206 (2003)
• [Publications] Koh Takeuchi: "Structural basis of the KcsA K^+ channel and agitoxin2 pore-blocking toxin interaction by using the transferred cross-saturation method"Structure. 11. 1381-1392 (2003)
• [Publications] Lee CW: "Molecular basis of the high-affinity activation of type 1 ryanodine receptors by imperatoxin A."Biochem J.. 377. 385-394 (2003)
• [Publications] Mitsuhiro Takeda: "Hyaluronan-recognition mode of CD44 revealed by cross-saturation and chemical shift perturbation experiments"J.Biol.Chem. 278. 43550-43555 (2003)
• [Publications] Hiroto Kawashima: "^1H, ^<13>C, and ^<15>N backbone resonance assignments of the hyaluronan-binding domain of CD44"J.Biomol.NMR. (In Press). (2003)