ミトコンドリア外膜透過装置の立体構造と通過中のポリペプチド鎖のコンホメーション

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15032239
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前仲 勝実 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (10322752)
• Keywords: ミトコンドリア / Tom40 / 膜タンパク質 / 界面活性剤 / リフォールディング

Research Abstract

ミトコンドリア外膜に存在する膜透過装置においてTom40タンパク質がチャネルを形成している。このチャネルのポアを通過して前駆体タンパク質が輸送される。立体構造はβバレルからなるポーリン型であると予想されている.大腸菌を用いて酵母のTom40全長を発現すると,インクルージョンボディとなった.6M尿素を用いて可溶化し,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製を行い、大腸菌1L培養当たり60〜70mgの変成状態のTom40タンパク質を得ることができた。膜タンパク質の立体構造解析においては使用する界面活性剤の選択が鍵となる。そこで、我々はCD、NMR、電子顕微鏡・負染色、ブルーネイティブ-PAGE、界面活性剤存在下でのゲルろ過などを指標として27種類の界面活性剤のスクリーニングを行い、Tom40の巻き戻しに有効であると思われるものを5種類選択した(DDM,OG,SML,Brij35,C_<12>E_6).ついで,Tom40の巻き戻し方法を,希釈法,ゲルろ過に直接インジェクションする方法,ヒスタグを用いてカラムに固定しながら変性剤を取り除く3つの方法について検討した.その結果、ゲルろ過カラムによる巻き戻し法が最も有効であった.ボイドボリュームよりあとの位置のピークから,電子顕微鏡・負染色観察で穴が1つあいたリング状の粒子が確認された.また,CDおよびNMRでβシート構造が含まれることが判明した.しかしながら,安定性が低く1日経過すると変性状態へもどっていた.また,機能的な指標としてのプレタンパク質(pSu9-DHFR)との特異的な結合は検出できなかった.