エンドサイトーシスの分子機構:分子構造から細胞機能まで

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15079206
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 竹居 孝二 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (40322226)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山田 浩司 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80325092) ; 絹田 正裕 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (40135942)
• Keywords: エンドサイトーシス / 小胞輸送 / 無細胞系 / ライブイメージグ / リポソーム / ダイナミン / アンフィファシジン

Research Abstract

1)Amphiphysin 1によるdynaminのGTPアーゼ活性の調節
Amphiphysin 1のノックアウトマウスの脳細胞質は野生型マウスの脳細胞質に比べ小胞形成が減少すること、Dynaminによる小胞形成はAmphiphysin 1により増加することを明らかにした。さらに、Amphiphysin 1はDynaminのGTPアーゼ活性を増強させ、このためには酸性リン脂質が大型リポゾームとして存在することが必要であることを明らかにした。Amphiphysin 1の変異体を用いた解析から、脂質に結合するBARドメイン、Dynaminに結合するSH3ドメインが必要であることを明らかにし、エンドサイトーシス過程におけるDynaminのGTPアーゼ活性調節、小胞形成の機構に関するモデルを提唱した。
2)膜脂質-タンパクの相互作用の解析
Amphiphysin 1、Dynamin 1と膜脂質の結合をバイオセンサーを用いて解析し、これらのタンパクと脂質膜との結合は、固定された脂質膜に対しては相加的であることが示した。
3)Amphiphysin 1の3次元構造解析
結晶構造解析のために、高純度のAmphiphysin 1を精製する系を確立した。
4)機能タンパクのリン酸化による影響
DynaminとAmphiphysinの活性がCDK5によるリン酸化により、小胞形成、膜結合性が調節されることを明かにした。
5)小胞形成過程のリアルタイム観察
蛍光ラベルしたphosphatidylethanolamineを含む単層大型のリポソームを脳細胞質と反応させ、リポソーム表面からの突起形成、形成された突起の凝集を超高速共焦点レーザー顕微鏡により観察した。同様に蛍光ラベルした単層大型のリポソームを、DynaminおよびAmphiphysinと反応させたところ、より明瞭なチューブ状突起の形成が観察された。

Research Products

• [Publications] K.Tomizawa: "Cophosphorylation of amphiphysin I and dynamin I by Cdk5 regulates clathrin-mediated endocytosis of synaptic vesicles"Journal of Cell Biology. 163. 813-824 (2003)
• [Publications] 絹田 正裕: "イノシトールリン脂質によるエンドサイトーシスの制御機構"生化学. 75. 1449-1452 (2003)
• [Publications] M.Krauss: "ARF6 stimulates clathrin/AP-2 recruitment to synaptic membranes by activating phosphatidylinositol phosphate kinase type Iγ"Journal of Cell Biology. 162. 113-124 (2003)
• [Publications] 竹居 孝二: "蛋白質 核酸 酵素"ダイナミンとエンドサイトーシス(印刷中). (2004)