2003 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内及び膜界面の分子を可視化する新手法の創案と展開
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15105003
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
梅澤 喜夫 東京大学, 大学院・理学系研究科, 教授 (80011724)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 守俊 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (00323501)
小澤 岳昌 東京大学, 大学院・理学系研究科, 講師 (40302806)
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| Keywords | 蛍光プローブ / 脂質セカンドメッセンジャー / 蛋白質リン酸化 / 蛍光共鳴エネルギー移動 |
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| Research Abstract |
(1)細胞内の主要な脂質セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸(PIP_3)を,蛍光顕微鏡下の単一細胞で可視化分析するために新規蛍光プローブ分子(fllip:フリップ)を開発した.これにより,1)血小板由来成長因子(PDGF)などのペプチドホルモン刺激により,PIP_3が細胞膜のみならず小胞体膜やゴルジ体膜などendomembraneで大量に増加することを見いだした.また,II)このendomembraneでのPIP_3は,エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたチロシンキナーゼ受容体に刺激されてendomembrane上で生合成されたものであることを明らかにした(Nature Cell Biol., 5,1016(2003)).
(2)プロテインキナーゼAktの活性化に基づく蛋白質リン酸化を可視化検出する蛍光プローブ(Aktus;アクタス)を開発し,ペプチドホルモンのインスリンは内皮細胞のゴルジ体にAktを局在化・活性化させるが,女性ホルモンのエストロジェンはゴルジ体のみならずアポトーシス抑制に重要なオルガネラのミトコンドリアにもAktを局在化させ活性化することを見いだした(J.Biol.Chem.,247,30945(2003))
(3)生きた細胞内でのタンパク質間相互作用を検出する発光プローブを開発した.renilla luciferase (RLuc)のN末から91番目で切断し,各々にY941ペプチドとSH2nを連結した.両タンパク質を発現した細胞にインシュリンを添加すると,リン酸化Y941ペプチドとSH2nとが相互作用し,二分したRlucが近接して発光能を回復することを見出した.Y941のリン酸化を発光強度を指標に時空間解析できることを実証した(Anal.Chem.,75,4176(2003)).
(4)生きたマウス個体内におけるタンパク質の核内移行検出プローブを開発した.二分したRlucにinteinを連結すると,スプライシング反応により二分したRlucが再連結して,効率よく再構成されることを見出した.この二分したRlucを用いて,ARのサイトゾルから核内への移行を検出するプローブを作製した.プローブを発現したCOS-7細胞に男性ホルモン(DHT)を添加した時,DHT濃度に依存してRLucの発光強度が増大することが分かった.このプローブをマウス脳内に移植して,マウス個体内のDHT検出法を開発した.procymidoneやPCBをマウスの腹腔に投与すると,脳内のARの働きが抑制されることを明らかにした(投稿中).
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[Publications] M.Awais, M.Sato, K.Sasaki, Y.Umezawa: "A Genetically Encoded Fluorescent Indicator Capable of Discriminating Estrogen Agonists from Antagonists in Living Cells"Anal.Chem.. (In press). (2004)
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[Publications] M.Sato, Y.Ueda, T.Takagi, Y.Umezawa: "Production of PtdInsP_3 at endomembranes is triggered by receptor endocytosis"Nature Cell Biology. 5,No.11. 1016-1022 (2003)
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[Publications] A.Kaihara, Y.Kawai, M.Sato, T.Ozawa, Y.Umezawa: "Locating a protein-protein interaction in living cells via split Renilla luciferase complementation"Anal.Chem.. 75,No.16. 4176-4181 (2003)
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[Publications] K.Sasaki, M.Sato, Y.Umezawa: "Fluorescent Indicators for Akt/Protein Kinase B and Dynamics of Akt Activity Visualized in Living Cells"J.Biol.Chem.. 247,No.33. 30945-30951 (2003)
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[Publications] T.Ozawa, Y.Sako, M.Sato, T.Kitamura, Y.Umezawa: "A Genetic Approach to Identifying Mitochondrial Proteins"Nature Biotech. 21. 287-293 (2003)
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[Publications] T.Nishino, T.Ito, Y.Umezawa: "Selective Observation of Hydroxy and Carboxylate Moieties by Scanning Tunneling Microscopy Using Chemically Modified Tips with Differing Extent of I Hydrogen Bond Acidity or Basicity"Journal of Electroanalytical Chemistry. 550-551. 125-129 (2003)
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[Publications] S.B.Kim, T.Ozawa, Y.Umezawa: "A Screening Method for Estrogens Using an Array-Type DNA Glass Slide"Anal Sci. 19. 499-504 (2003)
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[Publications] S.B.Kim, T.Ozawa, Y.Umezawa: "A Screening Method for Estrogens Using an Array-Type DNA Glass Slide"Anal Sci. 19. 499-504 (2003)
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[Publications] H.Aoki, K.Hasegawa, K.Tohda, Y.Umezawa: "Voltammetric detection of inorganic phosphate using ion-channel sensing with self-assembled monolayers of a hydrogen bond-forming receptor"Biosensors and Bioelectronics. 18,No.2-3. 261-267 (2003)
