真核生物染色体DNA複製開始領域における複製因子集合の分子機構

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15207012
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 荒木 弘之 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 教授 (20151160)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上村 陽一郎 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助手 (20321599) ; 田中 誠司 国立遺伝学研究所, 細胞遺伝研究系, 助手 (50263314)
• Keywords: DNA複製 / 複製開始 / 複合体形成 / 酵母 / CDK

Research Abstract

出芽酵母の染色体DNA複製開始に関わる因子の集合に関して以下のような結果を得た。
1,複製の開始には,多数の複製因子が開始領域に結合しなければならない。これら因子の結合に必要なGINSと複合体を作る因子を調べた。弱い結合により作られる複合体を調べる目的で,ホルマリンによりクロスリンクさせた後,GINS複合体と共免疫沈降する因子を調べた。その結果,DNAポリメラーゼε(Polε)とGINS複合体が細胞周期を通じて結合していること,S期に入るとこの複合体にDpb11,Sld2が加わることを明らかにした。
2,GINSの昆虫細胞の発現系から,Polε,Dpb11,Sld2は酵母から精製する系を確立したが,酵母からの精製量が少なく今後の課題である。これらタンパク質を用いて,1で同定した複合体の再構築を試みる予定である。
3,Dpb11はCDKによりリン酸化されたSld2と効率よく結合する。Sld2は11ヶ所のCDKによるリン酸化部位を持つが,結合にはその内1ヶ所のリン酸化が必須であるを明らかにした。他の部位のリン酸化は,結合に必須なリン酸化部位のリン酸化レベルを調節しているようである。
4,我々が分離したSld3は,Cdc45と結合して複製開始に必要である。Sld3も12ヶ所のCDKによるリン酸化部位を持つ。これらのリン酸化部位に変異を導入することによりSld3の機能に影響を与えるか調べた。その結果,2ヶ所のリン酸化部位を同時に変異させると,細胞増殖に欠損を持つことが明らかになった。このことは,Sld3もCDKによるリン酸化の基質であることを示唆する。