LINEのレトロトランスポジションに必須な機能領域の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15370003
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 藤原 晴彦 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 助教授 (40183933)
• Keywords: non-LTRレトロトランスポゾン / LINE / 転移機構 / レトロトランスポジション / テロメア / SART / 逆転写酵素 / ORF1

Research Abstract

昆虫のテロメア反復配列にだけ転移するLINE (SART)をテロメアに転移させ効率的に検出する系を用い、LINEの転移に必須と考えられる機能領域を解析した。
1 ORF1内部の機能解析
LINEがゲノムDNAに転移するには細胞質から核への移行が必要であるがそのメカニズムはわかっていない。予備的な実験からSARTのORF1のN末端に近い領域とC末端に近い領域の2箇所に核移行に関わるシグナルがあると予想された。そこで、これらの領域を数十ベース以内に限定した後、その領域内に変異、欠失を入れた変異LINEを作成し、in vivo転移アッセイにより機能構造を解析した。その結果、新規な核移行シグナルを発見するとともに、C末端部分のZnフィンガーが転移に必須であることを発見した。
2 逆転写ドメインの機能領域
LINEの転移は標的DNAの切断と同時に逆転写がおこることから、レトロウィルスやLTR型レトロトランスポゾンとは異なる性質の逆転写酵素をコードしている可能性が高い。そこで、逆転写酵素ドメインとその近傍領域に変異を入れ、機能領域を解析した。その結果、ドメイン内部の複数のアミノ酸サイトが必須であるとともに、逆転写酵素ドメインの上流と下流の配列が転移に必須であることを見出した。さらに、バキュロウィルス感染細胞から細胞抽出液を調製し、in vitroでの転移系を構築することに成功した。
3 LINE mRNAの3'UTR領域の機能解析
SARTを含めLINEの多くは、mRNAの3'UTRの領域が転移に必須である。3'UTR変異体の転移活性の検定からその領域を限定し、機能領域を解明しようと考えた。変異体を作成して領域を限定したところ、3'UTRの内部の約100塩基の構造が転移に必須であること、またpolyAは転移位置の正確性に関与していることを発見した。

Research Products

• [Publications] 小島健司, 藤原晴彦: "昆虫のテロメア維持機構"放射線生物研究. 39. 39-50 (2004)
• [Publications] Matsumoto, T., Takahashi, H., Fujiwara, H.: "Targeted nuclear import of ORF1 protein is required for in vivo retrotransposition on telomere-specific non-long terminal repeat retrotransposon, SART1."Mol.Cell.Biol.. 24. 105-122 (2004)
• [Publications] Kojima, K.K., Fujiwara, H.: "Cross-genome screening of novel sequence-specific non-LTR retrotransposons : various multicopy RNA genes and microsatellites are selected as targets."Mol.Biol.Evol.. 21. 207-217 (2004)
• [Publications] Kojima, K.K., Fujiwara, H.: "Evolution of target specificity in R1 clade not-LTR retrotransposons."Mol.Biol.Evol.. 20. 351-361 (2003)
• [Publications] Lobbia, S., Niitsu, K., Fujiwara, H.: "Female-specific wing degeneration caused by ecdysteroid in the tussock moth, Orgyiarecens : Hormonal and developmental regulation of sexual dimorphism formation."J.Insect Science. 3. 1-7 (2003)
• [Publications] Hwang JS, et al.: "cDNA cloning and mRNA expression of L-3,4-dihydroxyphyenylalanine decarboxylase gene homologue from the silkworm, Bombryx mori."Biotechnol Lett.. 25. 997-1002 (2003)