高等真核生物生細胞におけるクロマチン構造変換と遺伝子発現制御

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15370073
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 木村 宏 京都大学, 医学研究科, 研究員(科学技術振興)(常勤形態) (30241392)
• Keywords: FRAP / GFP / クロマチン / ヌクレオソーム / ヒストン / 遺伝子発現 / 染色体 / 転写

Research Abstract

当該研究の目的は,GFPを融合したヒストンやRNAポリメラーゼを安定に発現する哺乳類培養細胞株を用いることにより,生細胞においてクロマチン構造変換に関わる因子の過剰発現や発現抑制がヌクレオソームの安定性と転写活性全般に与える影響を解析し,生細胞の核内におけるヌクレオソーム構造変換と転写活性との関係を明らかにすると同時に,それらの因子の生細胞における役割について解明することであった.具体的な計画では,クロマチン構造変換に関わると予想される因子を過剰発現させたときのGFP融合ヒストンの動態を解析し,また転写活性に与える影響をプロモウリジンの取り込みを指標に測定しようと試みた.まず、NAP1 (nucleosome assembly protein 1)やASF1 (anti silencing function 1)/CIA (CCG1-interacting factor A)などの発現ベクターを作製し,それらの過剰発現の影響を解析したが,少なくともH2Bの動態には影響を与えないとの結果が得られた.そこで,現在過剰発現ではなくRNAiを用いた発現抑制系を用いて同様の解析を行うこと,および,H2B以外のヒストンの動態を調べることを検討している.また,新規のクロマチン構造変換に関わる因子を生化学的に同定するための解析手法の確立を試みた.非イオン性界面活性剤を用いて細胞膜を透過性にした細胞(膜透過化細胞)を作製し,GFP融合ヒストンを発現する細胞から調製した細胞抽出液を添加すると,生細胞で見られるH2A-H2Bの真正クロマチンへのターゲッティングとH3-H4の複製したクロマチンへの取り込みが見られた.このことは,膜透過化細胞において生細胞と同様のクロマチン構造変換が再現できたことを示している.今後,この新たに確立された系を用いてヒストンのアセンブリと分子交換に必要な因子を同定することが出来ると期待できる.

Research Products

• [Publications] Yasutoshi Tatsumi: "The ORC1 cycle in human cells : I. Cell cycle-regulated oscillation of human ORC1"Journal of Biological Chemistry. 278(42). 41528-41534 (2003)
• [Publications] Caroline Duringer: "HAMLET interacts with histones and chromatin in tumor cell nuclei"Journal of Biological Chemistry. 278(43). 42131-42135 (2003)
• [Publications] Hiroshi Kimura: "Measuring histone and polymerase dynamics in living cells"Methods in Enzymology. 375. 381-393 (2004)
• [Publications] Michiko Muraki: "Manipulation of alternative splicing by a newly developed inhibitor of Clks"Journal of Biological Chemistry. (in press). (2004)
• [Publications] 木村 宏: "細胞核構造と機能のストカスティックな制御"生物物理. 43(5). 234-239 (2003)
• [Publications] 木村 宏: "時間軸にわたる染色体機能の変化"医学のあゆみ. 208(10). 890-894 (2004)
• [Publications] 竹安邦夫, 米田悦啓(編者): "細胞核のダイナミクス"シュプリンガー・フェアラーク東京(仮題)(印刷中). (2004)