RNAポリメラーゼの機能制御による転写包括制御の全体像

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15370079
• Research Institution: Nippon Institute for Biological Science
• Principal Investigator: 石浜 明 財団法人日本生物科学研究所, 研究部, 主任研究員 (80019869)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩田 晃 財団法人日本生物科学研究所, 研究部, 主任研究員 (70193745) ; 本田 文江 財団法人日本生物科学研究所, 研究部, 研究員 (80343747)
• Keywords: 転写制御 / 転写因子 / RNAポリメラーゼ / SELEX / タンパク-DNA相互作用 / FeBABE / 二成分制御系 / タンパクリン酸化

Research Abstract

大腸菌RNAポリメラーゼは、7種類のシグマ因子、300種類の転写因子との相互作用で、遺伝子認識特異性が変り、その結果、ゲノムの発現パターンが変化する。転写包括制御の全体像の解明を目的とした研究を実施し、本年度次の成果を得た。研究は、順調に進展し、原核生物の転写研究のブレークスルーに成功した。
1)シグマ因子、転写因子遺伝子欠損株のプロテオーム、トランスクリプトープ解析から、各因子の支配下の遺伝子群を推定した。
2)全シグマ因子、約150種類の転写因子を発現、精製した。純化転写因子をゲノムDNA断編と混合して、転写因子に結合するDNA断片コレクションを構築する実験系を確立した。幾つかの転写因子については、DNA配列の分析から、ゲノム上の転写因子の結語部位のマッピングを行った。
3)これら多面的なアプローチで同定した各転写因子の結合サイトを含むプロモーターを単離し、我々が開発した、蛍光タンパク2種類をもつプロモーター活性測定ベクターに挿入し、細胞内での転写因子の影響を解析した。
4)転写因子による調節様式は、再構成RNAポリメラーゼによる単離プロモーター試験管内転写系に、純化転写因子を加えることで解析した。
5)転写過程での転写因子の作用様式は、RNAポリメラーゼとの接点と相関する。先に我々が開発した人工プロテアーゼFeBABEを結合した転写因子と再構成RNAポリメラーゼを利用した転写反応中に切断されたRNAポリメラーゼサブユニットを分析することで決定する実験系を開発した。この系を利用して幾つかの転写因子に関して新に接点を同定した。
6)純化転写因子で家兎を免疫し抗体を作製した。抗体を利用したウエスタン法で、約50種類の転写因子に関して、細胞内濃度を測定し、また培養条件と、培養時間による変動を実測した。
7)二成分系の転写因子に関しては、30種類の純化センサーキナーゼと34種類の純化転写因子を用いたリン酸化反応を解析し、センサーキナーゼと基質転写因子の全ての組み合わせを同定したが、約20の異種二成分系間の組み合わせでも、リン酸化のクロストークがあることを発見した。

Research Products

• [Publications] Kim, J., Yoshimura, S.H., Hizume, K., Ohniwa, R.L., Ishihama, A., Takeyasu, K.: "Fundamental structural units of the Escherichia coil nucleoid revealed by atomic force microscopy."Nucleic Acids Res.. 32(6). 1982-1992 (2004)
• [Publications] Mitsuzawa, H., Kanda, E., Ishihama, A: "Rpb7 subunit of RNA polymerase II Interacts with an RNA-binding protein involved in processina of transcripts."Nucleic Acids Res.. 31(16). 4696-4701 (2004)
• [Publications] Yang, J., Hwang, S., Irawaty, W., Ishihama, A., Pittard, J.: "Modes of action of the TyrR protein, which result in repression and activation of the tyrP promoter of Escherichia coil."Mol.Microbiol.. 52(1). 243-256 (2004)
• [Publications] Burrows, P.C., Ishihama, A., Buck, M., Wigneshweraraj, S.R.: "Mapping sigma 54-RNA polymerase interactions at the -24 consensus promoter element."J.Biol.Chem.. 278(32). 29728-29743 (2003)
• [Publications] Eguchi, Y., Oshima, T., Yamamoto, K., Ishihama, A., Utsumi, R.: "Transcription regulation of the drug efflux genes by EvgAS, a two-component system in Escherichia coil."Microbiology. 149(10). 2819-2828 (2003)
• [Publications] Gowrishankar, J., Yamamoto, K., Subbarayan, P.R., Ishihama, A.: "In vitro properties of RpoS (σ^s) mutants of Escherichia coli with postulated N-terminal subregion 1.1 or C-terminal region 4 deleted."J.Bacteriol.. 185(8). 2673-2679 (2003)
• [Publications] Johnson, D.C., Ishihama, A.Stevens, A.M.: "Involvement of region 4 of the sigma 70 subunit of RNA polymerase in transcription activation of the lux operon during quorum sensing."FEMS Microbiol.Lett.. 228(2). 193-201 (2003)
• [Publications] Macchi, R., Montesissa, L., Murakami, K., Ishihama, A., de Lorenzo, V., Bertoni, G.: "Recruitment of σ^<54>-RNA polymerase to the Pu promoter of Pseudamonas putida through integration host factor-mediated positioning switch of subunit carboxy-terminal domain on an UP-like element."J.Biol.Chem. 278(30). 27695-27702 (2003)
• [Publications] Makinoshima, H., Aizawa, S., Hayashi, H., Miki, T., Nishimura, A., Ishihama, A.: "Growth phase-coupled alterations in cell structure and function of Escherichia coli."J.Bacteriol.. 185(4). 1338-1345 (2003)
• [Publications] Minagawa, S., Ogasawara, H., Yamamoto, K., Eguchi, T., Oshima, T., Ishihama, A., Utsumi, R: "Identification and molecular characterization of Mg(II)-regulon of Escherichia coli."J.Bacteriol.. 185(13). 3696-3702 (2003)
• [Publications] Mitsuzawa, H., Ishihama, H.: "RNA polymerase Ii transcription apparatus in Schizosaccharomyces pombe."Curr.Genet. 44(6). 287-294 (2003)
• [Publications] Yamamoto, K., Ishihama, A.: "Two different modes of transcription repression of the Escherichia coli acetate operon by IcIR."Mol.Microbiol. 47(1). 183-194 (2003)
• [Publications] Kimura, M., Mitsuzawa, H., Ishihama, A.: "The Molecular Biology of Schizosaccharomyces pombe"Pro Edit GmbH, Heidelberg. 450 (2004)
• [Publications] Meares, C.F., Datwyler, S.A., Schmidt, B.D., Owens, J., Ishihama, A.: "Meth.Enzymol."Acade, oc Press. 355 (2003)