魚類の腫瘍壊死因子(TNF)の構造と機能に関する研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15380136
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 中西 照幸 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (00322496)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 裕基 日本大学, 生物資源科学部, 助手 (50333571) ; 吉浦 康寿 養殖研究所, 病害防除部, 研究員 (90372052) ; 杣 源一郎 徳島文理大学, 健康科学研究所, 教授 (00158990)
• Keywords: ニジマス / TNFα / LPS / mRNA発現 / 定量PCR法 / 組換えニジマスTNF / ドチザメ / CCケモカイン

Research Abstract

ニジマスにおける2種類のTNFαが異なった機能を有するかどうか明らかにするために、クローンニジマスにLPSを投与後経時的に各種組織を採取し、TNFαmRNAの発現量をReal-time PCR法により定量した。その結果、頭腎、脾臓、鰓及び腸管ではTNF-2に比べてTNF-1の強い発現が認められたが、肝臓においてはTNF-2の強い発現が認められた。このことから、臓器間で2種類のTNFが異なる役割を担うことが示唆された。
アユTNFのgenomic DNAについて解析した結果、エクソン・イントロン構造は哺乳類と同様であることが明らかとなった。LPSを腹腔内投与したアユより経時的に頭腎、脾臓、肝臓を摘出し、TNF遺伝子の発現変化について調べた。その結果、いずれの臓器においても、LPS刺激後3時間後で最も強い発現がみられ、アユにおいてもLPSによるTNFの発現誘導メカニズムが備わっていること、およびLPS投与による感染防御にTNFが関与することが示唆された。
個体発生に伴うTNF mRNAの発現解析のために、ニジマスを用いて受精直後より発眼までの各発育段階のサンプルを採取した。また、ニジマスTNFのプロモーター領域及びGFP遺伝子を組み込んだトランスジェニックゼブラフィッシュ及びニジマスを作製した。
大腸菌発現系を用いて組換えニジマスTNFを作製するとともにポリクローナル抗体を作製した。しかし、TNFに高い感受性を示すL929細胞に対する細胞障害活性は認められなかった。次年度は、酵母発現系等を用いて生理活性を有するTNFの作製を試みる。
ドチザメよりSSH法により3種類のCCケモカイン遺伝子の単離に成功し、これら遺伝子のエクソン・イントロン構造及びプロモーター領域の解析を行った。また、これらCCケモカイン遺伝子は脾臓、心臓及び鰓において発現していることが判明した。

Research Products

• [Publications] Inoue Y., M.Endo, C.Haruta, T.Taniuchi, T.Moritomo, T.Nakanishi: "Molecular cloning and sequencing of the silver chimaera (Chimaera phantasma) interleukin-8 cDNA"Fish & Shellfish Immunol.. 15. 269-274 (2003)
• [Publications] Inoue, Y., Haruta, Usui, K., Moritomo, T., T.Nakanishi: "Molecular cloning and expression of shark interleukin-8 cDNA"Fish & Shellfish Immunol.. 14. 275-281 (2003)
• [Publications] Yoshiura, Y., I.Kiryu, A.Fujiwara, H.Suetake, Y.Suzuki, T.Nakanishi, M.Ototake: "Identification and characterization of Fugu orthologues of mammalian interleukin-12 subunits"Immunogenetics. 55. 296-306 (2003)
• [Publications] Inoue, Y., Y.Yoshiura, T.Moritomo, M.Ototake, T.Nakanishi: "Molecular Cloning and Sequencing of Japanese pufferfish (Fugu rubripes) NADPH oxidase cDNAs"Dev.Comp.Immunol.. (印刷中). (2004)
• [Publications] Ohno, S., Inagawa, H., Dhar, DK., Fujii, T., Ueda, S., Tachibana, M., Suzuki, N., Inoue, M., Soma, G-I., Nagasue, N.: "The Degree of Macrophage Infiltration into the Cancer Cell Nest is a Significant Predictor of Survival in Gastric Cancer Patients"Anticancer Research. 23. 5015-5022 (2003)
• [Publications] Fukushima, T., Yamamoto, M., Oshiro, S., Tsugu, H., Hirakawa, K., Soma, G-I: "Recombinant mutant human tumor necrosis factor-alpha (TNF-SAM2) immunotherapy with ranimustine chemotherapy and concurrent radiation therapy for malignant astrocytomas"Anticancer Research. 23. 4473-4481 (2003)
• [Publications] Ohno S., Suzuki N., Ohno Y., Inagawa H., Soma G-I., Inoue M.: "Tumor-associated Macrophages : Foe or Accomplece of Tumors?"Anticancer Research. 23. 4395-4410 (2003)
• [Publications] Yoshimura, H., Dhar, DK., Nakamoto, T., Kotoh, T., Takano, M., Soma, G-I, Nagasue, N: "Prognostic significance of tumor necrosis factor receptor in colorectal adenocarcinoma"Anticancer Research. 23. 85-89 (2003)
• [Publications] Kamei, H., T.Ohira, Y.Yoshiura, N.Uchida, H.Nagasawa, K.Aida: "Expression of a biologically active recombinant follicle stimulating hormone of Japanese Eel Anguilla japonica using methylotropic yeast, Pichia pastoris"Gen Comp Endocrinol. 134. 244-254 (2003)
• [Publications] 杣源一郎, 稲川裕之, 河内千恵: "マクロファージと健康維持"健康創造研究会誌. 2. 105-112 (2003)
• [Publications] 杣源一郎, 稲川裕之, 河内千恵: "自然免疫とマクロファージ"News Letter. 2. 17-20 (2003)
• [Publications] Soma, G-I., Kuroki, M., Fukushima, T.: "Proceedings of the Sixth Meeting of the society of Biotherapeutic Approaches. Special Issue"International Institute for Anticancer Research. 137 (2003)