網膜疾患に対する血液網膜関門のGLUT1を介した抗酸化物質輸送の意義

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390046
• Research Institution: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 細谷 健一 富山医科薬科大学, 薬学部, 教授 (70301033)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺崎 哲也 東北大学, 未来科学技術共同研究センター, 教授 (60155463) ; 登美 斉俊 富山医科薬科大学, 薬学部, 助手 (30334717)
• Keywords: 血液網膜関門 / TR-iBRB細胞 / vitamin C / GLUT1 / 酸化的ストレス / 輸送機構 / 条件的不死化細胞株

Research Abstract

Vitamin Cの網膜への輸送は網膜内vitamin C濃度を制御していると考えられ、血液網膜関門におけるvitamin Cの輸送機構の解明は網膜を酸化的ストレスから保護する上で重要である。本研究では、条件的不死化網膜毛細血管内皮細胞株(TR-iBRB)を内側血液網膜関門のin vitroモデルとして用い、vitamin Cの輸送機構を解明することを目的とした。Vitamin Cの輸送解析は酸化型のdehydroascorbic acid(DHAA)と還元型のascorbic acid(AA)の^<14>Cラベル体を用いて行った。TR-iBRB細胞における[^<14>C]DHAAと[^<14>C]AAの取り込みは少なくとも3分までは直線性を示し、[^<14>C]DHAAの初期取り込み速度は[^<14>C]AAよりも37倍高いことが示された。TR-iBRB細胞におけるの[^<14>C]DHAA取り込みはNa^+非依存性、濃度依存性(Km=93μM)を示した。さらに、[^<14>C]DHAA取り込みは促進輸送型ヘキソース輸送担体(GLUT)の基質であるD-glucose、3-O-methyl-D-glucoseおよび2-deoxyglucoseや阻害剤であるphloretinおよびcytochalasih Bによって強く阻害された。D-Glucoseによる[^<14>C]DHAAの取り込み阻害定数(IC_<50>)は5.6mMであった。RT-PCR解析の結果TR-iBRB細胞にはGLUT1、GLUT3およびNa^+-dependent vitamin C transporter(SVCT)2mRNAの発現が示された。リアルタイム定量PCRの結果、GLUT1mRNAの発現量はGLUT3に比べ37倍高く、SVCT2に比べ402倍高いことが示された。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫染色解析からTR-iBRB細胞はGLUT1およびGLUT3がタンパクレベルで細胞膜表面に発現していることが示された。以上の結果から、内側血液織関門におけるvitamin C輸送は主にDHAAとしてGLUTを介して輸送されていることが示された。

Research Products

• [Publications] T.Kondo: "Establishment of conditionally immortalized rat retinal pericyte cell lines (TR-rPCT) and their application in a co-culture system using retinal capillary endothelial cell line (TR-iBRB2)"Cell Struct.Funct.. 28. 145-153 (2003)
• [Publications] S.Ohtsuki: "In vitro study of the functional expression of organic anion transporting polypeptide 3 at rat chorold plexus epithelial cells and its involvement in the cerebrospinal fluid-to-blood transport of estrone-3-sulfate"Mol.Pharmacol.. 63. 532-537 (2003)
• [Publications] M.Tomi: "Expression and regulation of L-cystine transporter, system X_c^-, in the newly developed rat retinal Muller cell line (TR-MUL)"Glia. 43. 208-217 (2003)
• [Publications] S.Mori: "Organic anion transporter 3 is responsible for brain-to-blood efflux of homovanillic acid at the abluminal membrane of rat brain capillary endothelial cells"J.Cereb.Blood Flow Metab.. 23. 432-440 (2003)
• [Publications] L.Shen: "Recombinant arginine deiminase as a differential modulator of inducible (iNOS) and endothelial (eNOS) nitric oxide synthetase activity in cultured endothelial cells"Biochem.Pharmacol.. 66. 1945-1952 (2003)
• [Publications] T.Terasaki: "New approaches to in vitro models of the blood-brain barrier drug transport"Drug Discov.Today. 8. 944-954 (2003)