プロテオミクスによる神経因性疼痛に関与するタンパク質複合体の機能的解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390109
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 伊藤 誠二 関西医科大学, 医学部, 教授 (80201325)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 絹見 朋也 産業技術総合研究所, ヒューマンストレスシグナル研究センター, 研究員 (90293125) ; 西澤 幹雄 関西医科大学, 医学部, 講師 (40192687)
• Keywords: プロテオミクス / MALDI-TOF-MS / 一次求心性線維 / 脊髄 / NMDA受容体 / 慢性疼痛 / 神経可塑性 / 極性

Research Abstract

体性感覚の一次求心性線維の細胞体は後根神経節に局在し、皮下で自由神経終末となり末梢での刺激に反応する一方、脊髄後角で神経細胞とシナプスを形成して、末梢からの情報を中枢に伝達する。最近、NMDA受容体のtrafficking(細胞内移動)が神経の可塑性変化に関与することが注目されている。しかしながらin vivoにおいてNMDA受容体複合体の変化がどのように病態生理に関与しているかは不明である。今年度は、1)後根神経節細胞で産生された蛋白が一次求心性線維の末梢と中枢端に輸送される分別機構(極性)と、2)慢性疼痛に伴うNMDA受容体複合蛋白組成の変化をプロテオミクス手法を用いて解析し、機能性分子の同定を行うことを目的とし研究を行った。
1)ラット坐骨神経の後根神経節より中枢側と末梢側をサンプルとし、約1万個のスポットの検出が可能な高解像度のラージサイズ(20×70cm)のゲルを用いた2次元電気泳動法により分離後、スポットを銀染色にて検出し発現を比較検討した。発現量および有無といった差異のあるユニークスポットの中で末梢側からはcollagenの、そして中枢側からは複数のタイプのtubulinなどの構造蛋白をMALDI-TOF-MSを用いて同定した。来年度は検出されているユニークスポットの同定と現在解析しているpI5-6以外でのrangeにおいて解析を予定している。
2)ラットおよびマウス脊髄を試料としNMDA受容体が複合体を形成した状態で可溶化する条件下において、NMDA受容体のscaffold蛋白として知られるPSD-95の極めて特異性の高い抗体を用い免疫沈降を行った。得られた画分を泳動分離後、NMDA受容体のサブユニットであるNR1、NR2およびNR2Bの抗体を用いて複合体の共沈を確認した。来年度は本条件を用いスケールをアップしその他の分子についてTOF-MSで同定し、慢性疼痛におけるそれらの機能解析を行う予定である。

Research Products

• [Publications] Mabuchi, T.: "Attenuation of neuropathic pain by the nociceptin/orphanin FQ antagonist JTC-801 is mediated by inhibition of nitric oxide production."Eur.J.Neurosci.. 17. 1384-1392 (2003)
• [Publications] Muratani, T.: "Functional characterization of prostaglandin F_<2α> receptor in the spinal cord for tactile pain (allodynia)."J.Neurochem.. 86. 374-382 (2003)
• [Publications] Minami, T.: "Functional evidence for interaction between prostaglandin EP3 and κ-opioid receptor pathways in tactile pain induced by human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) glycoprotein gp120."Neurophamacology. 45. 96-105 (2003)
• [Publications] Muratani, T.: "Preemptive analgesia by Zaltoprofen in a mouse model of post-operative pain through blockade of the bradykinin B_2 pathway."J.Pharmacol.Exp.Ther.. (in press). (2004)
• [Publications] Koda, N.: "Synthesis of prostaglandin F ethanolamide by prostaglandin F synthase and identification of bimatoprost as a potent inhibitor of the enzyme-new enzyme assay method by LC/ESI/MS."Arch.Biochem.Biophys.. (in press). (2004)
• [Publications] Otsuji, T.: "Monitoring for dynamic biological processing by intra-molecular bioluminescence resonance energy transfer system using secreted luciferase."Anal.Biochem.. (in press). (2004)
• [Publications] 伊藤 誠二: "痛み-基礎・診断・治療-"朝倉書店. 407 (2003)