中枢神経に発現するチャネル・受容体を標的とした小児てんかんの責任遺伝子の同定

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390329
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Fukuoka University
• Principal Investigator: 廣瀬 伸一 福岡大学, 医学部, 助教授 (60248515)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上野 伸哉 浜松医科大学, 医学部, 助教授 (00312158) ; 上原 明 福岡大学, 医学部, 助教授 (60140745) ; 満留 昭久 福岡大学, 医学部, 教授 (30038749) ; 岡田 元宏 弘前大学, 医学部, 講師 (10281916) ; 兼子 直 弘前大学, 医学部, 教授 (40106852)
• Keywords: チャネル / 受容体 / てんかん / 中枢神経 / 遺伝子

Research Abstract

申請者らが収集・管理している遺伝子バンクを利用して 1.既知の中枢神経発現イオンチャネル・チャネル内臓型受容体の遺伝子に関して、網羅的に変異を高速スクリーニングする。
2.発見された変異を該当cDNAに組込み、培養細胞に発現させ、異常を生理学的に検証する。
3.ゲノム情報より、未知の候補イオンチャネル・チャネル内臓型受容体の遺伝子を検索し、中枢神経発現を確認し、1〜2のスクリーニングシステムに乗せる。
15年度
(1)変異のスクリーニング
1)PCRプライマー設計・作成
内向き整流K^+チャネル数種の行程に適した約300bp長ずつを増幅できるプライマーを設計作成した。
2)対象症例の選択
現在収集している遺伝子バンク中の異なった病型のうち、典型例数例を対象として選択した。遺伝子異常が判明した既知の病型と類似またはチャネル・受容体との関連が特に疑われる病型(欠神や熱性けいれん頻回例)を優先した。
3)変異スクリーニング
高速化を図るため、PCR増幅、産物の精製、泳動検定等、すべて工程は96穴プレート単位で行った。(約200例)PCR産物の塩基配列中に変異がないか次の方法で検索した。高速シークエンスPCR産物をそのまま直接シークエンス法にて解析を行った。(福岡大学現有のABI3100、310、377と共同実験施設の理化学研究所のメガシークエンサーABI3700を利用)。ダイターミネーター反応、精製、乾燥まですべて96穴プレート単位で行った。
(2)変異のチャネル・受容体の生理学的検証
てんかん患者で発見された、変異をHEK細胞に発現させ、その電気的特性について現在パッチクランプにて解析を実施中。

Research Products

• [Publications] Hirose S., et al.: "The genetics of febrile seizures and related epilepsy syndromes."Brain Dev. 25. 304-312 (2003)
• [Publications] Hirose S., et al.: "X-Linked mental retardation and epilepsy : Pathogenetic significance of ARX mutations."Brain Dev. 25. 161-165 (2003)
• [Publications] Okada M., et al.: "Age-dependent modulation of hippocampal excitability by KCNQ-channels."Epilepsy Research. 58. 81-94 (2003)