異種移植における遅延型拒絶反応の抑制―補体制御と糖鎖抗原の改変―

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390377
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 宮川 周士 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (90273648)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村上 博 日本動物工学研究所, 取締役研究部長(研究職) ; 岡部 勝 大阪大学, 遺伝情報実験施設, 教授 (30089875) ; 白倉 良太 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (00116047) ; 福田 大輔 株式会社ニプロ総合研究所, 研究員(研究職)
• Keywords: 補体抑制因子 / DAF / MCP / 膜残存補体 / 糖鎖抗原 / α-Gal抗原 / ブタislet / α1,3GT活性

Research Abstract

1。補体抑制因子による膜残存補体C4,C3に対する機能の検討
【方法】まず、DAFのもつ補体制御機能をMCP、膜型C1-INHと比較した。次に、cofactor活性を持つ分子間、MCP、CR1(SCR8-11)、膜型C4bp(SCR1-3)で比較した。これらをCHO細胞に遺伝子導入し、安定発現株を作成した。FACSで発現を確認した後、細胞障害抑制機能をLDH assayで、また補体沈着(C4,C3)量をFACSで測定・検討した。
【結果】1.全分子ともCHO細胞に高発現した。2.DAFはC3沈着、引き続く細胞傷害をよく制御したが、C4沈着は制御しなかった。3.MCPはDAFに比べ、C3沈着および細胞傷害の制御に劣ったが、若干のC4制御機能をしめした。4.膜型C1-INHはC4沈着を約40%制御した。5.CR1(SCR8-11)はDAF機能に類似した。6.C4bp(SCR1-3)は弱いながらもC4、C3の双方の沈着を抑制した。
【まとめ】DAFに求め得ない機能であるC4沈着を避けるには、膜型C1-INHと膜型C4bp(SCR1-3)が有効であった。
2。α-Gal抗原後の糖鎖抗原の検討をするために、α1,3GTのknockoutvectorを作成し、まず、ブタの血管内皮(PEC)をつかってin vitroでknockoutをかけ、目的cloneを得た。次に、ブタ胎児繊維芽細胞を使ってknockoutをかけたが、現在2000cloneほどあげたが、目的とするものはなかった。
3。ブタisletの糖鎖抗原の解析。賭場よりブタの膵臓を入手し、isletを分離し、α-Galの発現をみたが、抗体染色(His、FACS)およびHPLCにてα1,3GTの活性を調べたが、いずれもα-Galの発現・活性を認めなかった。

Research Products

• [Publications] Fukuta D, Miyagawa S, et al.: "Effect of Various forms of C1 esterase inhibitor (C1-INH) and DAF on complement mediated xenogeneic cell lysis"Xenoransplantation. 10. 132-141 (2003)
• [Publications] D Fukuta, S Miyagawa, et al.: "Effect of various forms DAF(CD55) and C1 esterase inhibitor (C1-INH)"Transtrant Proc. 35. 519-520 (2003)
• [Publications] K.Matsunami, S.Miyagawa, et al.: "Functional analysis of HSV-gC1 on swine endothelial cell"Transtrant Proc. 35. 538-539 (2003)
• [Publications] D Fukuta, S Miyagawa, et al.: "Effect of hybrid complement regulatory proteins on xenogeneic cells"Biochem Biophys Res Commun. 306. 476-482 (2003)
• [Publications] Da Fukuta, S Miyagawa, et al.: "The heavy chain is not required for the serine protease function of the membrane bound form of factor I on a xeno-surface"Transplant Immunol. (In press). (2004)
• [Publications] H Komoda, S Miyagawa, et al.: "A study of adult pig islets profiles"Xenoransplantation. (In press). (2004)