PD1リガンド遺伝子発現による移植免疫寛容の誘導とその心筋細胞移植への応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390415
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 榊田 悟 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (90311753)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福嶌 教偉 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (30263247) ; 澤 芳樹 大阪大学, 医学部附属病院, 助教授 (00243220) ; 白倉 良太 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (00116047) ; 松宮 護郎 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (20314312)
• Keywords: PD1 / 副刺激分子 / T細胞 / 免疫寛容

Research Abstract

C57BL/6マウス脾細胞からRNAを調整し、PCR法を用いて、B7.1,B7.2,ICOS ligand(ICOSL),PD1 ligand 1(PDL1),PD1 ligand 2(PDL2)分子の全長cDNAを作製した。各cDNAをCMV promoterを持つTransfer vector(Q-BIO gene)にクローニングしたのち、全長配列を決定し、PCR cloningに伴う塩基配列置換が生じていないことを確認した。次に各cDNAを含んだTransfer vectorを、各々Adenovirus backboneを含んだプラスミッドpAdEasy-1(Q-BIO gene)と共に、大腸菌BJ5183にTransformし、カナマイシン耐性と目的遺伝子の含有の両者を指標として、バクテリア内相同組み替えによって生じる、目的遺伝子含有、E1/E3欠損アデノウイルス骨格プラスミッドを作製した。
作製プラスミッドを293A細胞に形質導入し、プラーク形成法にて、単一プラスミッドから生じるアデノウイルスを調整した。各遺伝子に対して、6-8個のプラーク(計37個)を単離し、各々10^9個程度のウイルスを得る程度まで増幅した。作製ウイルスをHeLa細胞に感染させ、HeLa細胞内での目的遺伝子RNAの発現量を定量RT-PCR法で測定し、目的遺伝子の産生量が高いものを選択した。またHeLa細胞感染後の培養上清のPCR試験とHeLa細胞への再感染実験から、作製ウイルス中に、正常細胞中での増殖能力を再獲得した野生形アデノウイルスが含まれていないことを確認した。
現在さらにHeLa細胞あるいはラット培養筋芽細胞への感染後に、目的分子を細胞表面に表出するか否かをFACS解析で検討している。アデノウイルス作製には安全配慮に多数の工程と時間が必要であるが、現状では概ね予想通りにウイルス作製が進んでいると考えている。

Research Products

• [Publications] Z.Li, S.Kitagawa-Sakakida, K.Horiguchi et al.: "Antibody deposition in rat heart which develops transplant vasculonathy in (Donor x Recipient) E1 environment"Surgery Today. 33. 509-517 (2003)
• [Publications] 榊田悟ほか共著者51名: "免疫・アレルギー疾患用語解説集"エクセル企画出版. 347 (2003)