新規タンパク機能解析手法としてのEBNA1遺伝子組み込み細胞株の樹立とその応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390497
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 藤戸 章 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (60315950)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浮村 理 京都府立医科大学, 医学研究科, 助手 (70275220) ; 水谷 陽一 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (10243031) ; 松田 修 京都府立医科大学, 医学研究科, 助教授 (00271164) ; 三木 恒治 京都府立医科大学, 医学研究科, 教授 (10243239) ; 沖原 宏治 京都府立医科大学, 医学研究科, 助手 (80285270)
• Keywords: EBNA1 / oriP / stable transfection / 泌尿器癌 / 細胞株

Research Abstract

(1)タンパク機能解析用ベクターの作製
EBNA1遺伝子とEBNA1タンパクの認識配列であるoriP elementがあらかじめ組み込まれたInvitrogen社のpCEP4をもとに、マーカー遺伝子であるlacZ, Luciferase, GFPを組み込んだplasmid(pCEP.β,pCEP.Lu, pCEP.GFP)を作製した。さらに,EBNA1遺伝子をdeletionし,oriPを残したplasmidの作製も試みているが,ligation siteの決定が困難であり,まだ改変plasmidの完全な確立には至っていないのが現状である.
(2)基本となる安定形質発現株の作製
同時並行して種々の遺伝子導入試薬を用いて,泌尿器癌細胞株へのplasmidの至適導入条件の設定を行った.ヒト前立腺がん細胞株であるLNCaP, DU145,PC-3,ヒト腎細胞癌株であるNC65,ACHN, Caki-1について,それぞれの細胞株ごとに至適導入試薬と至適導入条件をほぼ決定することができた.今回検討した泌尿器癌細胞株の非ウィルスベクターによる遺伝子導入効率は概ね10%程度であり,コントロールとして用いているマウスメラノーマ細胞株であるB16に比し,明らかに低率であった.また,遺伝子導入効率の高い導入試薬ほど,初期の細胞障害活性が高くなる傾向が認められた.さらに,EBNA1遺伝子導入株も作製中であるが,G418選択の段階での細胞障害が強く認められている.この原因として導入plasmidのsizeに比例して,細胞障害性が強くなる傾向が認められた.これに対する対策として,制限酵素にて必要部位のみのDNA断片となるようにlinear化したのちに導入する方法を試みている.今後は速やかに,安定したEBNA1タンパク発現株の樹立,DNA micro-arrayを用いた遺伝子発現プロファイルの解析に移りたいと考えている.