動物細胞ゲノムへの突然変異導入機構の解析-DNA修復経路の系統的ノックアウト動物細胞株を用いて-

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15510049
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 園田 英一朗 京都大学, 医学研究科, 助教授 (50281093)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田野 恵三 京都大学, 原子炉実験所, 助教授 (00183468)
• Keywords: ニワトリDT40 / 相同組換え / 損傷乗り越え修復 / 複製フォーク停止 / H2AX / Rev3 / 染色体安定性 / タモキシフェン

Research Abstract

我々は、ニワトリ40細胞を使い、動物細胞における様々な修復欠損株作製し、その機能を解析している。
今回DNA複製時重要な働きをすると考えられるに複製後修復について解析した。複製後修復の重要な2つの経路、すなわち相同組換えと損傷乗り越え修復を同時に欠損した株(ΔRad54/ΔRad18,ΔRad54/ΔRev3)を作製した。その結果、これらの株が染色体断裂を多発して死亡することを見いだした。すなわち、相同組換えと損傷乗り越え修復は、互いにオーバーラップしながら、細胞内でたえず発生している複製停止からの複製再開に必須の働きをしていることを明らかにした。これらは動物細胞にはみられない特有な現象である。動物細胞では複製後修復は細胞生存にとって必須の修復系である。
また、複製後修復にrad18欠損DT40細胞が、臨床的に、頻用されている乳ガン予防剤タモキシフェンに高感受性を示すことを発見した。さらに詳細に調べた結果、その感受性はその下流の損傷乗り越えに関わる分子Rev3の欠損でもみられることがわかった。さらに、染色体分析の結果により、その感受性はタモキシフェンが直接DNAに傷を付けているためにもたらされていることを証明した。このように、変異株をつかうことで、様々な薬剤および環境変異物質のDNA毒性を鋭敏に検出できることを証明した。(論文Mizutani et al. Extensive chromosomal breaks are induced by tamoxifen and estrogen in DNA repair-deficient cells. Cancer Res 64,3144-3147(2004).
さらに、2重鎖切断に重要な働きをしているヒストンH2Aの亜種であるヒストンH2AXの変異株を作製した。この変異株は2重鎖切断修復、とりわけ相同組換えを介した修復に異常を示した。さらに、相同組換え機能が低下している、XRCC3変異株との2重変異株を作製するとその表現型は致死となった。このように、H2AXは染色体の構成因子であり、DNA修復、すなわち相同組換えが自然発生する染色体断裂の修復に必須であることを考えると、このようなヒストン修飾は組換えを効率よくおこなわせることで、染色体安定性の保持に重要な役割をしていることを証明した。(現在、論文作製中)

Research Products

• [Journal Article] Similar effects of Brca2 truncation and Rad51 paralog deficiency on immunoglobulin V gene diversification in DT40 cells support an early role for Rad51 paralogs in homologousrecombination. (2005)
  • Author(s): Hatanaka A, Yamazoe M, Sale JE, Takata M, Yamamoto K, Kitao H, Sonoda E et al.
  • Journal Title: Mol Cell Biol 25 Pages: 1124-1134
• [Journal Article] Extensive chromosomal breaks are induced by tamoxifen and estrogen in DNA repair-deficient cells. (2004)
  • Author(s): Mizutani, A., Okada, T., Shibutani, S., Sonoda, E., Hochegger, H., Nishigori, C., Miyachi, Y., Takeda, S., Yamazoe, M.
  • Journal Title: Cancer Res 64 Pages: 3144-3147
  • Description: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [Journal Article] Reverse genetic studies of the DNA damage response in the chicken B lymphocyte line DT40. (2004)
  • Author(s): Yamazoe, M., Sonoda, E., Hochegger, H., Takeda, S.
  • Journal Title: DNA Repair 3 Pages: 1175-1185
• [Journal Article] Analysis of Scc1-deficient cells defines a key metaphase role of vertebrate cohesin in linking sister kinetochores. (2004)
  • Author(s): Vagnarelli, P., Morris C., Dodson, H., Sonoda, E., Takeda, S., et al.
  • Journal Title: EMBO Rep 5 Pages: 167-171
• [Journal Article] Recombination repair pathway in the maintenance of chromosomal integrity agains DNA interstrand crosslinks. (2004)
  • Author(s): Sasaki, M.S., Takata, M., Sonoda, E., Tachibana, A., Takeda, S.
  • Journal Title: Cytogenet Genome Res 104 Pages: 28-34
• [Journal Article] Post-replication repair in DT40 cells : translesion polymerases versus recombinases. (2004)
  • Author(s): Hochegger, H., Sonoda, E., Takeda, S.
  • Journal Title: Bioessays 26 Pages: 151-158