ポリリン酸とATPの特異性に関わる酵素ドメインの機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15560676
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 黒田 章夫 広島大学, 大学院・先端物質科学研究科, 助教授 (50205241)
• Keywords: ポリリン酸 / ATP / グルコキナーゼ / タンパク質工学 / リン酸化 / 基質特異性

Research Abstract

ポリリン酸依存性グルコキナーゼ遺伝子(pgk)をHisタグ融合ベクターであるpET21aに挿入し、大腸菌内に導入した。得られた大腸菌形質転換株を培養したところ、ポリリン酸依存性グルコキナーゼが大量発現していることが確認できた。Hisタグ融合タンパク質を精製するカラムを用いて精製した結果、純度90%の標品が得られた。更にイオン交換クロマトグラフィー等で精製をすすめ、100%純度のものを得た。この高純度精製したポリリン酸依存性グルコキナーゼとクリスタルスクリーニングキットを用いて現在結晶条件を検討している。現在までにいくつか結晶が得られたが、X線解析の結果、すべて塩の結晶であることがわかっている。引き続き結晶化条件を検討する。ポリリン酸依存性グルコキナーゼとATP依存性グルコキナーゼの基質特異性の違いはIIB領域あるいはIIA領域の有無によるものと考えられた。すなわち、ATP依存性グルコキナーゼのIIB領域あるいはIIA領域は、リン酸化の基質をATPに限定するために存在するように考えられた。そこで、大腸菌のATP依存性グルコキナーゼを取得し、そのIIB領域あるいはIIA領域の一部を欠失させたグルコキナーゼを構築した。しかし、現在までに活性を持つ欠失体が得られていない。今後もATP依存性グルコキナーゼの欠失領域を変化させることによって、ポリリン酸を基質とするグルコキナーゼを取得したいと考えている。

Research Products

• [Publications] Tanaka S. et al.: "Strictly polyphosphate-dependent glucokinase in a polyphosphate-accumulating bacterium Microlunatus phosphovorus"Journal of Bacteriology. 185. 5654-5656 (2003)
• [Publications] 黒田章夫: "微生物におけるポリリン酸代謝制御機構の解明と利用"生物工学会誌. 81. 104-111 (2003)