ゲノム操作技術の開発―枯草菌の高頻度形質転換因子の解明―

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580070
• Research Institution: Sojo University
• Principal Investigator: 田口 久貴 崇城大学, 工学部, 助教授 (90212018)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 赤松 隆 崇城大学, 工学部, 教授 (50133567)
• Keywords: 高頻度形質転換 / 枯草菌 / プロトプラスト / コンピテント細胞 / pBluescriput II / pC194 / DNA結合タンパク質 / インバーティッドリピート

Research Abstract

pC194に大腸菌ベクターpBluescriput IIを連結したpCB1(精製DNA:7×10^4、無精製DNA:4×10^8)では、pC194(精製DNA:2×10^3、無精製DNA:2×10^2)より高頻度に形質転換体が得られる。この高頻度形質転換の機構解明を本研究の目的とする。
(1)高頻度をもたらすpBluescriput II上の配列の特定.pCB1からpBluescriput II内の配列を段階的に欠失させた各種デレーションクローンを作成した。各クローンによる形質転換率を測定して領域限定を行った。その結果、pBluescriput IIのf1からlac'遺伝子にまたがる約270bの領域を持つクローンで、pCB1の約20%の形質転換率を得た。この値は、pC194による形質転換率の約3万倍に当たる。この領域はGC含量が高く(61%)、2個のインバーティッドリピートが存在することが分かった。これらリピートとDNA結合タンパク質との相互作用の可能性が考えられた。現在、PCR増幅した各リピートを持つクローンを作成し、形質転換率を求めている。
(2)DNA結合タンパク質の分離精製技術の開発.多量体形成の少ないpUB110を用いて予備的実験を行った。供与DNAにpUB110を用いた場合、未精製DNAで精製DNAと比較して形質転換率が1000倍上昇することを認めた。pUB110を有する枯草菌のプロトプラストを調製後、セファクリルS500HRカラム(1.5×17cm)上で溶菌してゲル濾過によるpUB110の分離を行った(1.5ml分画)。ボイド体積付近に、高頻度形質転能を有するpUB110が溶出した。大部分の細胞内タンパク質画分はpUB110画分の直後から溶出し、染色体DNAの画分はタンパク質画分の後半に溶出した。分離したpUB110画分をアガロース電気泳動して、精製pUB110のバンドと比較した。その結果、分離pUB110バンドの移動度に、精製pUB110のものより明らかに遅延が認められた。この遅延はDNA結合タンパク質によるものと考えられた。pUB110の結合タンパク質のSDS-PAGEによる解析を行った。pUB110無保有株より同様の分離を行い、保有菌株とのタンパク質バンドの比較を行った。その結果、分子量143、109、78、58、54、50、48、,42、38kdのバンドで顕著な差が認められた。来年度は、これらのタンパク質のアミノ酸配列を決定して、各DNA結合タンパク質を特定する。