ゲノム操作技術の開発.枯草菌の高頻度形質転換因子の解明.

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580070
• Research Institution: Sojo University
• Principal Investigator: 田口 久貴 崇城大学, 工学部, 助教授 (90212018)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 赤松 隆 崇城大学, 工学部, 教授 (50133567)
• Keywords: 高頻度形質転換 / 枯草菌 / プロトプラスト / コンピテント細胞 / pBluescriptII / pC194 / DNA結合たんぱく質 / インバーティッドリピート

Research Abstract

pC194に大腸菌ベクターpBluescriputIIを連結したpCB1(精製DNA:7×10^4、無精製DNA:4×10^8)では、pC194(精製DNA:2×10^3、無精製DNA:2×10^2)より高頻度に形質転換体が得られる。この高頻度形質転換の機構解明を本研究の目的とする。
(1)高頻度をもたらす配列の特定.昨年度見出した高頻度(pCB1の20%)をもたらす配列(pBluescriput IIのf1からlac'遺伝子にまたがる約270bの領域)には、2個のインバーティッドリピートが存在する。PCR増幅した各リピートを持つクローンを作成し、形質転換率を求めたが、高頻度形質転換は認められなかった。本年度は、pBluescriputIIおよびpUB110の配列をPCRで500b毎に増幅し、得られた断片をpC194に連結し、形質転換率を測定して高頻度をもたらす配列を検索した。その結果、pBluescriputII上に、高頻度形質転換(pCB1の10%)をもたらす領域をさらに2箇所見いだした。pUB110に関しては、pC194の15000倍の高頻度さをもたらす領域(3021-3578)を見出した。わずか500bで、pCB1と同等の高頻度さを示した。
(2)DNA結合タンパク質の分離精製技術の開発.供与DNAにpUB110を用いた場合、未精製DNAで精製DNAと比較して形質転換率が1000倍上昇することを昨年度に認めた。昨年度行ったpUB110のセファクリルS500HRカラムで分離精製は、回収率など再現性が悪く、分離精製したpUB110の総活性(形質転換能)は1/100〜1/1000に低下した。各画分を混合しても活性の回復は認められなかった。タンパク質の安定性など原因を究明している。来年度は、本年度に見出したpUB110の500b配列を付与したアフィニティーカラムを調製し、DNA結合タンパク質の分離精製を試みる。