翻訳後修飾の網羅的解析に基づく機能未知遺伝子産物の機能予測及び機能解析法の確立

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580080
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 内海 俊彦 山口大学, 農学部, 教授 (20168727)
• Keywords: 翻訳後修飾 / 網羅的解析 / 無細胞タンパク質合成 / 代謝標識 / N-ミリストイル化

Research Abstract

翻訳後修飾の網羅的解析系の確立をめざして、in vitroおよびin vivo代謝標識法を用いたタンパク質翻訳後修飾の解析法の確立を行った。即ち、哺乳動物細胞中で生ずる主要な蛋白質修飾を指令する数アミノ酸残基から成る修飾シグナルを分子中に含有するモデル蛋白質cDNAのセットを構築し、これを犬膵臓ミクロソーム膜存在下、非存在下でのウサギ網状赤血球ライセートを用いたin vitro転写翻訳系、あるいはCOS細胞発現系で発現させ、各修飾反応に特異的なRI-標識基質の蛋白質への取り込みを検討し、各修飾反応の検出に最適な発現系と標識基質の組み合わせを検討した。その結果、Met脱離、N-アセチル化、N-ミリストイル化、メチル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、シグナルペプチド切断、シグナルアンカー化、N-グリコシル化、GPI-アンカー化、リン酸化・パルミトイル化・プロテアーゼ切断等の哺乳動物細胞で生ずる主要なタンパク質修飾がin vitroあるいはin vivo代謝標識法で検出可能であることが明らかになった。
また、タンパク質N-ミリストイル化をモデル修飾反応としてとりあげ、無細胞タンパク質合成系を用いたin vitro代謝標識法を用いて修飾反応に要求されるアミノ酸配列要求性を検討した結果、N-末端から3位、6位、7位に位置するアミノ酸の組み合わせが、N-ミリストイル化反応に大きく影響するという、これまで知られていなかった新たなアミノ酸配列要求性が見い出された。さらにこの配列要求性を適用することで、新たなN-ミリストイル化タンパク質を見い出すことが可能であることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Ohta, H. et al.: "B96Bom encodes a Bomyx mori tyramine receptor negatively coupled to adenylate cyclase"Insect Molecular Biology. 12. 217-223 (2003)
• [Publications] Arita, K. et al.: "Mechanism of enhanced apoptosis in HL-60 cells by UV-irradiated n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids"Free Radic. Biol. Med.. 35. 189-199 (2003)
• [Publications] Umigai, N. et al.: "Topogenesis of two transmembrane type K^+ channels, Kir2.1 and KcsA"J. Biol. Chem.. 278. 40373-40384 (2003)
• [Publications] Kanno, T. et al.: "Oxidative stress underlies the mechanism for Ca^<2+>-induced permeability transition of mitochondria"Free Rad. Res.. 38. 27-35 (2004)
• [Publications] Utsumi, T. et al.: "Vertical-scanning mutagenesis of amino acids in a model N-myristoylation motif reveals the major amino-terminal sequence requirements for protein N-myristoylation"Eur.J.Biochem.. 271. 863-874 (2004)
• [Publications] 内海俊彦: "「膜局在性のタンパク質工学的改変による生理活性タンパク質の機能変換」タンパク質工学"医学書院. 165-204 (2003)