2005 Fiscal Year Annual Research Report
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15590234
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
小口 勝司 昭和大学, 医学部, 教授 (50129821)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小山田 英人 昭和大学, 医学部, 助手 (50266160)
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| Keywords | リアノジン受容体 / 部分領域 / 緑色蛍光蛋白質(GFP) / カルシウム放出チャンネル / カルシウムイオン |
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| Research Abstract |
1.以前の改良により「カセット構造化」したリアノジン受容体1型cDNA(全長約15000塩基対)の5'末端側から系統的に各カセット毎(ほぼ等間隔に約1500塩基対のcDNA毎)に制限酵素により抜き出し、PCR法によって5'末端側にKozak配列を導入して各カセット毎の部分cDNAクローンを作製した。これらのカセット部分cDNAクローンを緑色蛍光蛋白質(GFP)をコードするcDNAとイン・フレームに挿入し、アミノ基末端側から約500アミノ酸配列ずつリアノジン受容体の部分領域をGFP融合蛋白質として発現させるための発現ベクター(6種類のクローン名:コードするアミノ酸配列番号、Cs1:1-184、Cs2:183-741、Cs3:740-1224、Cs4:1222-1743、Cs5:1742-2231、Cs6:2230-2777)を構築した。
2.これらGFP融合型リアノジン受容体1型部分領域の発現ベクターをCHO細胞に遺伝子導入して、約48時間の培養後に蛍光顕微鏡下で細胞を観察したところ、全6種類(Cs1〜6)のクローンでGFP蛍光が認められた。
3.このGFP蛍光の有無を確認した後に、ホルマリンもしくは冷メタノール処理により細胞固定を行って各固定法間でGFP蛍光の細胞内分布を比較検討したところ、Cs1クローンでは両固定法で共に細胞質にGFP蛍光が観察されたが、Cs2〜Cs6ではホルマリン処理ではGFP蛍光が残存したが、冷メタノール処理ではGFP蛍光が著しく減弱もしくは消失した。
4.以上の結果は、全長約5000個のアミノ酸配列から成るリアノジン受容体1型のアミノ基側前半部分において、Cs1のコードする1-184番目のアミノ酸配列の領域に細胞内Ca^<2+>貯蔵部位である小胞体への移行・維持に関わる領域が存在し、184-2777番目のアミノ酸配列には存在しないことを示唆する。
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