2004 Fiscal Year Annual Research Report
オステオポンチン蛋白多型の機能的差異を規定するドメインの解析
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15590346
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
宮崎 龍彦 愛媛大学, 医学部, 助手 (80239384)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
能勢 眞人 愛媛大学, 医学部, 教授 (70030913)
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| Keywords | オステオポンチン / 遺伝子多型 / 糸球体腎炎 / MRL / 1prマウス / 合成機能蛋白 / 機能解析 / TNF-α / IL-1β |
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| Research Abstract |
オステオポンチン蛋白多型が膠原病疾患群の発症・進展にどのような機序で関連するかについて明らかにするため、(1)合成多型OPN蛋白を作成してその構造的差異を解析、(2)OPN蛋白の多型構造を遺伝子工学的に改変することにより、どのドメインの多型が糸球体腎炎発症・進展に繋がるかを解明、さらに(3)OPN遺伝子座特異的コンジェニックマウス作成により、生体に於けるOPN多型の役割を確定するための解析を行った。
1.OPN蛋白多型の機能差異誘導ドメインの同定
(1)改変合成蛋白の構造解析:昨年度PCR based site directed mutagenesisにより作成した改変合成蛋白を解析し、OPN蛋白多型による構造的差異を規定しているドメインを明らかにした。
(2)合成多型OPNによる脾細胞、及び骨髄由来マクロファージに対するサイトカイン分泌誘導の定量的解析:MRL/Mp-+/+マウスの脾細胞,腹腔マクロファージおよび骨髄由来マクロファージを採取し、改変合成OPNを加えて短期培養し、mRNAを採取する。これをもとにリアルタイムPCRによる遺伝子発現定量システムを用いたRT PCRにより、蛋白多型によるサイトカイン発現誘導能の差異を解析した。
2.機能差異誘導ドメインの確定
前年度2.の(1)作成した改変合成蛋白のうち、上記(2)で機能改変を誘導し得たものにつき解析を行い、少なくとも、ある1カ所のアミノ酸置換が機能差を誘導するドメインであることを見出した。
3.OPN遺伝子座特異的コンジェニックマウスの確立と病態解析
(1)OPN遺伝子座特異的コンジェニックマウス系マウスの確立:selective congenicの手法により[MRL/lpr x(MRL/lpr x C3H/lpr)F1]-N13マウスを作成し、Opn遺伝子座特異的コンジェニック系マウス(MRL/lpr-Opn^<C3H>)を確立した。
(2)MRL/lpr-Opn^<C3H>コンジェニックマウスの病態解析:上記により確立したコンジェニックマウスを兄妹交配により繁殖させ、Opn^<MRL/MRL>,Opn^<MRL/C3H>およびOpn^<-C3H/C3H>の病態解析を行ってOpn^<-C3H/C3H>において自己免疫性糸球体腎炎が抑制されることを検証し得た。
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