2003 Fiscal Year Annual Research Report
C型肝炎ウイルスの共存受容体(co-receptor)の同定と解析
| Project/Area Number |
15590623
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
光井 洋 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (30239280)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸山 稔之 東京大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (30219571)
|
|---|
| Keywords | HCV / 受容体 |
|---|
| Research Abstract |
CD81安定発現細胞株の作成:HCV結合蛋白として報告されたヒトCD81をPCRでクローニングし、シークエンスを確かめた後、安定発現用のベクターに組み込んだ。その組み換えベクターをCOS7細胞に導入し、G418による選択によってヒトCD81の安定発現細胞株を作成した。得られたコロニーのうち、免疫細胞染色においてCD81の発現量が多いものを選び(COS-CD81と命名)、以後のクローニングの実験に使用した。
HCV共存受容体のクローニング:HCVはCD81と共存受容体の両者を介して感染するとの仮定のもとに、COS-CD81細胞を用いて発現クローニングをおこなう。ヒト肝臓cDNAに由来する発現ベクターライブラリー(大腸菌型)より、cDNA1万ずつの単位で大腸菌プレートを作成しプラスミドDNAを抽出した。このDNAプール36個、計36万の独立cDNAをスクリーニングの対象とした。LipofectionによりCOS-CD81細胞にcDNAを導入し、その後24時間から、培養上清に高タイターの1型HCV含有血清を加えた。その48時間後に細胞からRNAを抽出し、高感度のnested RT-PCRを用いてHCV-RNAの(-)鎖の増幅をおこなった。これにより細胞内に侵入し増殖したHCVが検出されるはずである。なおHCV-RNAの(+)鎖は多くのPCR産物で検出されたため、スクリーニングには使用できないことも判明した。現在、36プールのPCRがほぼ終了し、陽性プールの検討をおこなっている段階である。
|
Research Products
(1 results)
