2003 Fiscal Year Annual Research Report
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15590626
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
金井 文彦 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (70334399)
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| Keywords | C型肝炎ウイルス / プロテアーゼ阻害剤 / ペプチドライブラリー |
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| Research Abstract |
(1)NS3発現バキュロウイルスの作成
国立感染症研究所・鈴木哲朗博士から供与されたpUC3241(19)からNS3遺伝子をPCRで増幅し、遺伝子断片をバキュロウイルスでのタンパク発現ベクターpACGHLT-A(BD Biosciences Pharmingen社)にクローニングした。Bac-To-Bacバキュロウイルス発現システム(インビトジェン)を用いて昆虫細胞Sf9からウイルス液を調整した。
(2)NS3組変えタンパクの発現
Sf9細胞にGST-NS3を発現ウイルスを感染させ、4日後にSf9細胞を回収。Lysis bufferにて細胞を可溶化し、遠心分離後の上清を回収した。GST-NS3タンパクを含むLysateにGlutahione Sepharose Beadsを加えて、4℃にて3時間インキュベート。ビーズをLysis bufferにて洗浄後、Glutahione溶液にてGST-NS3タンパクを溶出した。溶出した組換えGST-NS3の一部を10%SDS-PAGE後、クマシー染色をおこなった。SDS-PAGE上、溶出されたタンパクの分子量は約43kDaで、融合タンパクの予想される分子量とほぼ一致した。またWestern blotにて、このバンドはNS3に対する抗体に特異的に反応することからGST-NS3であることが確認された。現在、精製タンパクを大量調整し、精製組換えタンパクのProtease活性をすでに基質として報告されている合成peptideを用いて測定している。
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