RNA interferenceを応用したC型肝炎ウイルス増殖抑制系の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15590629
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 坂本 直哉 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助手 (10334418)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡辺 守 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (10175127) ; 榎本 信幸 山梨大学, 医学部, 教授 (20251530)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / レプリコン・システム / RNA interference / small interfering RNA / アデノウイルスベクター / 分子標的治療 / 抗ウイルス療法 / 遺伝子導入療法

Research Abstract

我々は当該研究においてC型肝炎ウイルス(HCV)に対する新たな抗ウイルス療法の技術基盤を確立するため、ウイルス増殖モデルであるHCVレプリコンシステムを用いて、RNA interferenceを応用したHCV増殖抑制効果の解析を行い、今年度の成果として下記を得た。1.HC-J4株から独自に構築したレプリコンにおいて、特定のアミノ酸変異を有するクローンが高レベルのゲノム増殖を生じることを明かにした(J Viral Hepatitis 2004 in press)。2.独自に開発したキメラ・リポーター発現レプリコンシステムを用いて、インターフェロン、リバピリン等の薬剤を用いたウイルス増殖抑制効果の定量的解析の結果を報告した(J Infect Dls2004 in press)。3.HCVゲノムの5'非翻訳領域を標的とするsmall interfering RNA(siRNA)を設計・構築し、キメラ・リポーター発現レプリコン発現細胞に導入したところ、HCV増殖が有意に抑制され、ごく一部の配列に強い遺伝子破壊効果(最大96%)が認められた。さらに、細胞内でヘアピン型siRNAを発現するDNAプラスミドベクターを構築し抑制効果を確認した。以上の結果をEMBO Reportsに報告した。4.siRNAの細胞内における効果を持続させるため、siRNA発現アデノウイルスベクターを構築し、レプリコン発現細胞に感染させたところ、ウイルス増殖を持続的に抑制しウイルス増殖が完全に停止した。
今回設計したsiRNA発現アデノウイルスはin-vivoの発現抑制実験に応用可能であり、今後、HCV遺伝子発現トランスジェニックマウスでの肝細胞への導入効率、HCV蛋白発現抑制効果を検証していく。さらに、ウイルス増殖に関与する宿主蛋白を標的としたsiRNAを用いることにより、抗ウイルス療法の新たな標的分子の探索を遂行する予定である。

Research Products

• [Publications] Sakamoto N, Yokota T, et al.: "Inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by synthetic and vector-derived siRNAs"EMBO Reports. 4. 602-608 (2003)
• [Publications] Miyasaka Y, Sakamoto N, et al.: "Hepatitis C virus NS5A protein inhibits TNF-alpha mediated apoptosis in HUH7 Cells."J Infect Dis. 188. 1537-1544 (2003)
• [Publications] Maekawa S, Sakamoto N, et al.: "Introduction of NS5A Mutations Enables Subgenomic HCV-Replicon Derived from Chmpanzee-Infectious HC-J4 Isolate to Replicate Efficiently in Huh-7 Cells"J Viral Hepatitis. (in press). (2004)
• [Publications] Sakamoto N, et al.: "Synergistic inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by combination of ribavirin and interferon-alpha"J Infect Dis. (in press). (2004)
• [Publications] Sakamoto N.et al.: "Specific inhibition of hepatitis C virus replication by cyclosporin A"Biochem Biophys Res Com. 313. 42-47 (2004)