ファブリー病モデルマウスに対する遺伝子治療

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15590844
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 丸山 弘樹 新潟大学, 医歯学総合病院, 助手 (10293218)
• Keywords: naked DNA / CAG promoter / Fabry disease / α-galactosidase / hydrodynamics-based transfection / kidny-targeted gene transfer / renal vein / catheter

Research Abstract

本研究の目的は、ファブリー病に対する遺伝子治療を確立するための基礎的検討を行うことである。ファブリー病モデルマウスにcDNA発現plasmidベクターにヒトα-galactosidase A_(Gal A)cDNAを接続した遺伝子を導入し、遺伝子治療を行う。導入遺伝子は、ヒトα-Gal A cDNA遺伝子を強力な発現力を示すCAGプロモーターを持つcDNA発現プラスミドpKSCX(ヒトCMV-IEエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβ-グロビンポリ-A、カナマイシン耐性遺伝子)に接続して構築したpKSCX-α-Gal Aである。これを研究代表者が開発した方法(腎静脈へ注射する方法)(Hum. Gene Ther. 2002)を使って腎に導入し、治療効果について検討する。
1.遺伝子の導入方法の確立:研究代表者が開発したhydrodynamics-based transfectionによるラットの腎へのnaked plasmid DNAの導入方法を応用して、正常マウスの腎への遺伝子導入を検討した。正常マウスは、血中α-Gal A値が高いので、pKSCX-α-GaL Aを導入・発現させても、その効果を血中α Gal A値に反映させることは難しい。そこで、α-Gal A(101kDa)と同程度の分子量の蛋白を発現させられるか検討した。マウスの腎静脈は、ラットに比べて、細く短いが、全身麻酔下で、マウスを開腹し、左腎静脈と左腎動脈をクランプし、下大静脈と腹部大動脈との交通を遮断後、29Gのインスリン注射用シリンジを用いて、mouse IL-10/Fc(96kDa)発現plasmidベクターを導入、発現させることに成功した(Biochem. Biophy. Res. Commun. 2004)。
2.マウスの血液中、主要臓器中のα-galactosidase A濃度を分光蛍光光度計を用いて測定する方法を確立した。
3.10週齢のファブリー病モデルマウスの腎を電子顕微鏡で解析し、尿細管細胞にファブリー病患者と同様なGb_3の蓄積によるZebra bodyを認めた。
4.11週齢のファブリー病モデルマウスの腎にpKSCX-α-Gal Aを導入し、遺伝子治療の経過を観察中である。

Research Products

• [Publications] Haruo Hanawa: "A Novel Method to Assay Proteins in Blood Plasma after Intravenous Injection of plasmid DNA"Tohoku.J.Exp.Med.. (in press). (2004)
• [Publications] Hiroki Maruyama: "Rat kidney-targeted naked plasmid DNA transfer by retrograde injection into the renal vein"Mol.Biotechnol.. (in press). (2004)
• [Publications] Hiroki Maruyama: "Rat liver-targeted naked plasmid DNA transfer by tail vein injection"Mol.Biotechnol.. 26. 165-172 (2004)
• [Publications] H.Maruyama: "Post-secretion neutralization of transgene-derived effect : Soluble erythropoietin erythropoietin receptor /IgG.Fc expressed in liver neutralizes produced in muscle"J.Gene Med.. 6. 228-237 (2004)
• [Publications] S.Kameda: "Kidney-targeted naked DNA transfer by retrograde injection into the renal vein in mice"Biochem.Biophy.Res.Commun.. 14. 390-395 (2004)
• [Publications] Hiroki Maruyama: "Site-specific kidney-targeted plasmid DNA transfer using nonviral techniques. Review Article"Gene Ther.Mol.Biol.(invited review). 7. 221-229 (2003)
• [Publications] M.Kawai: "Ectopic bone formation by human bone morphogenetic protein-2 gene transfer to skeletal muscle using transcutaneous electroporation"Hum.Gene Ther.. 14. 1547-1556 (2003)
• [Publications] Hitoshi Hasegawa: "Antagonist monocyte chemoattractant protein 1 (CCL2) prevents the initiation and progression of lupus nephritis and renal vasculitis in MRI/lpr mice"Arthritis Rheum.. 48. 2555-2566 (2003)
• [Publications] S.Kameda: "Hydrodynamics-based transfer of PCR-amplified DNA fragments into rat liver"Biochem.Biophy.Res.Commun.. 309. 929-936 (2003)
• [Publications] Ken Ataka: "Effects of erythropoietin-gene electrotransfer in rats with adenine-induced renal failure"J.Am.Nephrol. 23. 315-326 (2003)
• [Publications] Hideaki Shimizu: "Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy attenuates renal injury induced by protein-overload proteinuria"J.Am.Soc.Nephrol.. 14. 1496-1505 (2003)
• [Publications] T.Ito: "Coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR)-positive immature osteoblasts as argets of adenovirus-midiated gene transfer for fracture healing"Gene Ther.. 10. 1623-1628 (2003)
• [Publications] N.Higuchi: "Hydrodynamics-based delivery of the viral interleukin-10 gene suppresses experimental crescentic glomerulonephritis in Wistar-Kyoto rats"Gene Ther.. 10. 1297-1310 (2003)
• [Publications] H.Maruyama: "Epidermis targeted gene transfer using in vivo electroporation. In Epidermal cells Methods and protocols. Methods in Molecular Biology Series"Humana Press(in press). (2004)