2004 Fiscal Year Annual Research Report

P/Q型カルシウムチャネル遺伝子のin vivo導入によるLEMS動物モデルの作製

Research Project

Project/Area Number	15590896
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	本村政勝長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 講師 (70244093)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	調漸長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (40264220) 江口勝美長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (30128160) 吉村俊朗長崎大学, 医学部, 教授 (80182822) 水澤英洋東京医科歯科大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (30144091)
Keywords	Lanbert-Eaton筋無力症候群 / P / Q電位依存性カルシウムチャネル / 動物モデル / α1A遺伝子 / 病態解析 / 標的抗原 / エピトープの解析
Research Abstract	Lamber Eaton筋無力症候群(Lambert Eaton myasthenic syndrome, LEMS)はP/Q型電位依存性カルシウムチャネル(P/Q-type voltage-gated calcium channel,P/Q型VGCC)が標的抗原であり、それに対する自己抗体が発症機序に重要であると考えられている。しかしながら、1)カルシウムチャネル自体の多様性、2)シナプトタグミンなどのカルシウムチャネル関連蛋白に対する自己抗体の出現、そして、3)血清抗P/Q型VGCC抗体が検出されない患者などの問題より、LEMSの標的抗原は確定していない。本研究では、その学問的な問いに答えるべく、LEMSの疾患誘導動物モデルを作成し、その病態解析、特に標的抗原、エピトープの解析を行うことを目的とする。第一段階は,α1A遺伝子発現アデノベクターの作製,アデノウィルスへの変換,そして,in vitroでのα1A subunitの発現の確認までを目標とする.次に、α1A subunitのin vitroの発現,P/Q型VGCC蛋白の確認をした後に,in vivo DNA免疫プロトコールに従い,第2段階の動物実験に移行する.免疫後に,動物の血清中の抗P/Q型VGCC抗体が上昇した所で,微小電極を用いた電気生理学的検討でLEMSの発症の有無について検討する.現在、Ishikawaら(Neurology,2001)によって作製されたP/Q型VGCCα1A遺伝子の供与を受け,そのα1A遺伝子のcDNAをアデノウィルスベクター用のシャトルベクターpHMVCMV6に組み込むに作業を行っている.この段階で手間取っていたが,最近,N型VGCC α1A遺伝子を組み込むことに成功した.この時の経験を応用して,再度,試みる予定である.次に,シャトルベクターA遺伝子遺伝子を,in vitro ligation法によりアデノウイルスベクター組換え,大量調整する.その後は,計画とうりに1x109pfu/mouseの精製アデノウイルスを,MHCの異なる数種のマウスに筋注(3週間の間隔で計3回)し,その後,血清中の抗P/Q型VGCC抗体を経時的に測定し,抗体価の上昇の有無を確認する.また臨床症状と微小電極を用いた電気生理学的検討でLEMSの発症の有無について検討する.