自己免疫性溶血性貧血における自己抗体産生メカニズムの解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591018
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 亀崎 豊実 自治医科大学, 医学部, 講師 (90316513)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥田 浩 自治医科大学, 医学部, 助教授 (50285772) ; 近江 俊徳 自治医科大学, 医学部, 助手 (40296091) ; 熊田 真樹 自治医科大学, 医学部, 助手 (40326830) ; 梶井 英治 自治医科大学, 医学部, 教授 (40204391) ; 岩本 禎彦 自治医科大学, 医学部, 教授 (10232711)
• Keywords: 自己免疫性溶血性貧血 / Rh血液型 / ミモトープ / Coombs陰性自己免疫性溶血性貧血 / CD47 / バンド3 / linear peptide / 交叉反応

Research Abstract

ファージペプチドライブラリーを用いた自己抗原エピトープレプリカの作製と抗原構造解析
1.AIHA患者由来抗赤血球自己抗体によるファージペプチドライブラリーのスクリーニング
AIHA患者由来抗赤血球自己抗体と同様に抗Rh抗体活性を示すモウノクローナル抗体により、ランダムペプチド(7アミノ酸)ライブラリーのバイオパンニングを行う。すなわち、ファージライブラリーと自己抗体を混合し、プロテインG結合磁化ビーズにより抗体結合ファージを選択する。洗浄後、酸性条件下で解離し、中和した後に再度磁化ビーズと反応させて、ネガティブセレクションを行う。ファージを増殖させた後、同様の方法によりさらに4回のパンニングを行う。
2.capture ELISAとmultiple sequence alignment解析
シングルコロニーより精製したファージを用いて、挿入塩基配列の決定と以下のcapture ELISAを行う。ファージディスプレイランダムペプチドライブラリー(New England Biolabs)において、抗D、抗Eの2種類のモノクローナル抗体によるバイオパンニングを行った。すなわち、ファージライブラリーと抗体を混合し、プロテインG結合磁化ビーズにより抗体結合ファージを選択した。ネガティブセレクションを行った後、ファージを増殖させ、同様の方法によりさらに4回のパンニングを行った。選択されたファージを精製し、挿入塩基配列の決定とcapture ELISA法により抗体との反応性を検討した。
3.分子モデルの作製
抗D、抗E抗体それぞれにおいてコンセンサス配列を持ったクローンが12クローン得られたことから、各抗体特異性配列の存在が示唆された。
4.アミノ酸相同配列検索
AIHA患者赤血球より解離した抗赤血球自己抗体とRh mimotopeの反応性を検討すると8例中3例に反応性を認めたことより、今回同定したRh mimotopeは自己抗原群mimotopeの一部であることが推測された。今後、複数のmimotopeを同定し、自己抗体同定・解析のためのパネル作製を目指したい。

Research Products

• [Publications] Kamesaki T: "A novel mutation inthe RHD gene in Japanese individuals with weak D, encoding an amino acid change in the 11th transmembranous domain of the RhD protein"Vox Sang. 84・2. 141 (2003)
• [Publications] Iwamoto S: "DNA-based identification resolved suspected misdiagnosis due to contaminated cytological specimens."Leg Med. 5・4. 246-250 (2003)
• [Publications] Omi T: "cDNA cloning, mapping and polymorphism of the porcine Rhesus (RH) gene."Anim Genet. 34・3. 176-182 (2003)
• [Publications] 岩本禎彦: "ラットABOホモログの遺伝子重複とその多型"DNA多型. 11・1. 38-41 (2003)