蛋白早期発現を利用した肝虚血再潅流傷害・低温保存傷害の制御法の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591404
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 梅下 浩司 大阪大学, 医学部附属病院, 助手 (60252649)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永野 浩昭 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (10294050) ; 左近 賢人 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (40170659) ; 金田 安史 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (10177537)
• Keywords: 肝臓 / 虚血・再潅流傷害 / RNA導入 / HVJエンベロープベクター / 蛋白導入 / マウス

Research Abstract

1.mRNAの合成
まず導入方法を確立するため、pcDNA3-luciferaseを用いてmRNAを合成した。方法としては、上記プラスミドを制限酵素で一本鎖にした後、mCAP RNA Capping Kitを用いて、安定したmRNAを合成、増幅した。
2.in vitroでのmRNA導入、蛋白発現の確認
1.で合成したmRNAを、HVJ Envelope VECTOR KIT (GenomeONE)を用いてvectorに封入し、BHK21細胞に導入した。コントロールとしてmRNA合成時にRNA polymeraseを加えていないものを同様にHVJ Envelope vectorに封入したものを用いた。Luciferase assayにて蛋白の発現を確認したところ、導入して4時間後で、コントロールに比べ約500〜1000倍の活性を認めた。
3.in vivoでのmRNA導入の至適条件の検討
2.と同様にして、luciferase (mRNA)をvectorに封入。6週齢、雄のC57BL/6マウスを用いて、経門脈的に導入した。導入の際には左グリソン枝をクランプし、右葉および尾状葉のみに注入されるようにした。導入して6時間後にマウスの肝を摘出し、Luciferase assayをおこなったところ、右葉は中葉、左葉に比べて約5〜10倍の活性を認めた。現在、より高い活性を得るべく、導入の至適条件を更に検討中である。