蛋白早期発現を利用した肝虚血再潅流傷害・低温保存傷害の制御法の開発

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591404
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 梅下 浩司 大阪大学, 医学部附属病院, 助手 (60252649)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金田 安史 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (10177537) ; 永野 浩昭 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (10294050)
• Keywords: 遺伝子導入 / 肝移植 / ex vivo / 超音波遺伝子導入法 / HVJ Envelope Vector

Research Abstract

1)ex vivoでの遺伝子導入の至適条件の検討(HVJ Envelope Vector法)
まずex vivoでの導入方法を確立するため、プラスミドを用いて至適条件の検討を行った。方法としては、HVJ Envelope VECTOR KIT(GenomeONE)を用いて、pcDNA3-luciferaseをvectorに封入し、摘出したラット肝グラフトに経門脈的に注入した。その後肝グラフトを同系のラットに移植し、24時間後にサンプリングした肝臓を用いてLuciferase assayをおこなった。その結果、活性はコントロール(vectorのみ導入時)と比べて約2〜3倍高い程度であった。
2)ex vivoでの遺伝子導入の至適条件の検討(超音波遺伝子導入法)
ex vivoで、より効率のよい導入方法を確立するため、超音波遺伝子導入法を用いて至適条件の検討を行った。方法としては、摘出したラット肝グラフトにpcDNA3-luciferaseプラスミドとマイクロバブル(Optison)を混合したものを経門脈的に注入し、超音波を15秒間照射した。その後肝グラフトを同系のラットに移植し、24時間後にサンプリングした肝臓のLuciferase assayをおこなったところ、コントロール(プラスミドのみ注入時)と比べて約17倍高い活性を示した。またプラスミド注入時および超音波照射時に血管クリップを併用することで、その活性は更に約10倍高い値を示した。次にFITC-oligoを用いて同様の方法で導入し、2時間後にサンプリングした肝臓を蛍光顕微鏡にて観察したところ、肝組織内にdiffuseに取り込まれていることを確認した。最後に肝障害の程度を調べるために血清ALTを測定したところ、コントロールよりわずかに高い値であった。