肺癌センチネルリンパ節微小転移検出法の開発-フローサイトメーターによる迅速診断-

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591476
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 金田 好和 山口大学, 医学部附属病院, 助手 (70325223)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上田 和弘 山口大学, 医学部附属病院, 医員(臨床) ; 村上 知之 国立病院機構山陽病院, 臨床検査部, 形態学室長 (20200272) ; 杉 和郎 国立病院機構山陽病院, 臨床検査部, 部長 (70241271)
• Keywords: 微少転移検出 / フローサイトメーター / 肺癌 / 迅速診断

Research Abstract

癌のリンパ節微少転移をフローサイトメーター(FCM)で検出する方法(FDL法)の開発に関して、平成16年度は以下のような研究を行い、成果を得た。
1.FDL法の基礎的・技術的検討
1)CK/CEA/DNA三重染色の検討
CK/DNA二重染色にてリンパ節細胞中の0.001%の癌細胞を検出することに成功したH15年度の成果を礎に、H16年度はさらに高い特異度を求めてCK/CEA/DNA三重染色を検討した。肺腺癌細胞株ABC-1を用いた。その結果、適切な染色条件は以下の通りであった。分散細胞を70%エタノールで20分固定し、エタノールの除去後、抗体希釈液で1回遠沈洗浄する。沈さに抗体希釈液を800μl添加し、撹拌する。このうち400μlを陰性コントロールとする。400μl細胞液にFITC標識抗cK抗体(DAKO,F0859)を50μl、及び、PE標識抗CEA抗体(BD,551478)を50μl添加し、撹拌する。陰性対照には蛍光標識抗Ig抗体を使用する。遮光状態で室温、20分間反応させる。7-AAD(BD,559925)を50μl添加・撹拌したのち、遮光状態で室温10分間反応させ、FCM測定する。なお、短時間に結果を出す術中迅速診断が目的でない場合は、より長い固定時間、免疫染色後の洗浄、より長い7AAD染色時間が望ましい。
2.FDL法の臨床的有用性に関する検討
1)患者リンパ節での比較検討
術中迅速診断に提出された肺癌患者のリンパ節(#1,#3,#7,#9,#10)の残りを用いて、癌病理診断とFDL法とで比較した(CK/DNA二重染色法)。その結果、病理診断で転移のみられた2つのリンパ節はFMLでも陽性と判定された。一方、#10リンパ節は病理診断では転移なしであったが、FDL法では陽性となった。FDLの臨床的有用性が示唆された。
2)術中迅速診断のための技術的検討
FDL法の研究を進めるなかで明かとなった大きな課題はFCMの測定速度の問題であった。文献的検討、ならびにメーカー技術者との検討の結果、市販のFCMは秒速1万個が限度であり、1個のリンパ節細胞を1台のFCMで全て測定するのに1日かかることが判明した。より高速に測定できる機種の開発が望まれる。