脊髄損傷に対する遺伝子導入マクロファージ移植の試み:ウイルスを用いない電気的遺伝子導入法を用いて

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591584
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 山本 晴康 愛媛大学, 医学部, 教授 (10092446)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾形 直則 愛媛大学, 医学部, 助手 (30291503)
• Keywords: Spinal cord / Macrophage / Rat / Gene / Motor function

Research Abstract

【目的】脊髄損傷に対する治療法の開発として、神経栄養因子の遺伝子を過剰発現させたマクロファージを神経損傷部に移植し、神経回復を図ることが本研究の目的である。
【方法】1)脊髄損傷モデルの作成:ラット脊髄を第11胸椎ラベルで椎弓切除し硬膜を露出し、硬膜外から圧迫を行い、脊髄損傷を作製する。
2)マクロファージの単離:ラット腹腔内にDMEMを50ml注入した後に開腹し、注入液を採取し、閉創する。採取したDMEMを遠心し、細胞濃度を調節する。
3)遺伝子導入:蛍光を発する遺伝子(GFP)のcDNAをプラスミドに組み込みんだ液体中(プラスミド0.1ug/ul)に採取したマクロファージを浮遊させ、電気的遺伝子導入装置(ネッパジーン社)を用いて電気的遺伝子導入(エレクトロポーレーション)を行う。
4)遺伝子導入マクロファージの移植:脊髄損傷後、直ちにラット硬膜内に25G針を用いて遺伝子導入マクロファージ浮遊液をL4/5椎間より注入する。
【結果と考察】今年度はまず、マクロファージに遺伝し導入する技術を確立し、それを硬膜内に注入することにより脊髄損傷後の神経組織にマクロファージがmigrationするかどうかを確認した。まず、培養マクロファージにエレクトロポレーションを用いてGFPの遺伝子を導入すると、培養条件で1週間後をピークに蛍光物質の産生が確認された。さらにこのマクロファージを硬膜内に移植し、脊髄損傷後1週間後に組織学的に検査を行うと、破壊された脊髄神経組織内に蛍光を発する細胞が多数生着していた。