ヒト精子DNA傷害定量法開発とそれを指標としたDNA損傷精子排除法の確立

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591781
• Research Institution: Tokyo Dental College
• Principal Investigator: 兼子 智 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (40214457)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田辺 清男 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (10101916) ; 石川 博通 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (60112679)
• Keywords: ヒト精子 / DNA / DNA損傷 / 電気泳動 / 薄膜ゲル

Research Abstract

ヒト精子DNA損傷を定量的に観察する方法の開発を行った。個々の精子のDNA損傷、とくにDNAの非特異的断片化を定量的に解析するための条件検討を行った。アガロース、シーナゲル各07%混合物を熱可溶化した後、細胞を30万/mlとなるように懸濁し、表面親水化処理したスライドグラス上に10μmとなるように薄膜ゲルを作成する。界面活性剤、アフィニティクロマトグラフィ精製トリプシン溶液に浸漬して、細胞融解、核蛋白の除去を行った。パルスフィールド電気泳動法により泳動を行うと、DNAがインタクトな細胞ではDNAファイバーが伸展するが、DNA損傷を有する細胞では糸状の泳動像の先に粒子状の断片化DNAを観察することができた。そのプロファイルは多様であった。従来の細胞電気泳動によるDNA断片化研究は粒子状の断片化DNA像の有無でDNA損傷を判定していたが、本研究で開発した手法では多様なDNA損傷像を観察することができた。
すでにヒト精子DNA断片化へのアポトーシスの関与が報告されている。ヒトリンパ球を部分精製し、アクチノマイシンDを添加して培養することにより、化学的にアポトーシスを誘導し、上記方法にてDNA断片化パターンを解析した。そのDNA断片化像はヒト精子で観察されたパターンと大きく異なっており、DNA断片化が必ずしもアポトーシスによるかは不明であり、さらに詳細な検討を要する。
DNA断片化を指標としてヒト精子精製法の検討を行った。上述した細胞電気泳動法により射精精液を観察すると、DNA断片化像を呈する精子の比率は20-70%程度であったが、Percollを密度勾配担体とする沈降速度差遠心分離法で精子を分離した後、イソキサゾールを担体とする沈降平衡法を組み合わせると、その比率は1-3%程度の低下させることができた。さらに詳細な条件検討を行い、精製効率の向上を図る予定である。