組み換え多角体を用いた相互作用するタンパク質の検出と分離

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15651084
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 秋田 求 近畿大学, 生物理工学部, 助教授 (80258061)
• Keywords: カイコ細胞質多角体病ウイルス / 多角体 / タンパク質相互 / ポリヘドリン

Research Abstract

カイコ細胞質多角体病ウイルスの多角体形成に関与するポリヘドリン遺伝子と、VP3にマウス由来のFosBを接続したキメラ遺伝子を含むバイナリーベクターを作成し、アグロバクテリウムを介してレタスやタバコBY-2細胞などを形質転換した。結果、ウエスタン法による検出ができたものの含量が少なく、生産物のサイズが小さくなっていたなど、さらに検討を要する問題が多いことが明らかになった。そこで、当初の予定を変更し、相互作用するタンパク質の分離が多角体を用いて可能かどうかをカイコ培養細胞を使って調製した多角体を使って確かめることにした。研究では、ホウレンソウ由来のチオレドキシン(Trx-m)を提示させた多角体を作成し、これを用いてTrx-mと相互作用するタンパク質群の分離を試みた。Trx-mとして、S-S結合の形成に関与するシステイン残基の一つをセリンに置換したTrx-m_<c41s>を用いた。これをVP3遺伝子に連結し、カイコ培養細胞を使用して組換え多角体を生産した。この多角体を用いて、ホウレンソウ葉緑体の粗抽出液からTrx-mと相互作用するタンパク質のいくつか(Rubisco Activaseなど)を分離することに成功した。具体的には、多角体をDTTで前処理して洗浄し、次にタンパク質と反応させ、最後にDTT処理して多角体から溶出させることで相互作用するタンパク質の分離を行うことができた。この洗浄方法や特異性の高さ、繰り返し利用性のなどについては今後も検討を続け、洗練された方法とする価値があると考えられた。