イネゲノムの高次構造の機能解明に向けたダイナミックなDNA欠失改変

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15651088
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 寺田 理枝 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (30137799)
• Keywords: イネ / Waxy遺伝子 / 欠失変異 / ターゲティング / 大規模アグロバクテリウム形質転換 / ポジティブ・ネガティブ選択 / アルコール脱水素酵素 / 相同組換え

Research Abstract

単子葉のモデル植物でかつ主要穀物であるイネの網羅的ゲノム情報の蓄積が急速に進みつつある状況下で、我々は、コメの主要成分である澱粉をつくるWaxy遺伝子を標的とした遺伝子ターゲティングを再現性のある実験系として確立することに世界で初めて成功した(Nature biotech.2002,20:1030)。本ターゲティング法での欠失変異誘導の可能性を探り、遺伝子機能解析のみならず遺伝子をコードしていないスペーサー領域の高次ゲノム保持機構を介した動的ゲノムの機能解明への展開を試みるため、まず、すでに確立したWaxy遺伝子で、Waxyのコード領域約3.0kbの欠失改変を行った。すでに構築した各々6.3kbと6.8kbの相同組換え領域を持つWxyターゲティング・ベクターの中間ベクターから、Waxyのコード領域約3.3kbを削除するターゲティング・ベクターを構築した。次いで、大規模アグロバクテリウム形質転換の更なる効率化を進め、この形質転換法に基づき同ベクターを用いて形質転換を行い、ポジティブ・ネガティブ選択後、相同組換え体のPCRスクリーニングを進めたところ、PCR解析で相同組換えが生じたと推定される複数のカルスを得た。再生系統を作出し、さらに詳しい解析を進めている。また冠水ストレスに関わるアルコール脱水素酵素(Alcohol dehydrogenase) Adh遺伝子は第11染色体短腕にAdh1とAdh2が約30kbの領域でタンデムに並んでいることから、Adh1とAdh2遺伝子のハイブリッド遺伝子をデザインしたターゲティング・ベクターによって一挙に約30kbを欠失させるゲノム改変をめざし、Adh領域30kb欠失誘導ターゲティング・ベクターの構築が完了した。

Research Products

• [Publications] Iida S, Terada R: "A tale of two integrations, transgene and T-DNA : gene targeting by homologous recombination in rice."Current Opinion in Biotechnology. (in press). (2004)
• [Publications] Terada R, Asao H, Iida S: "A large-scale Agrobacterium-mediated transformation procedure with a strong positive-negative selection for gene targeting in rice (Oryza sativa L.)."Plant Cell Reports. (in press). (2004)
• [Publications] 寺田理枝, 飯田 滋: "バイオベンチャー:相同組換えによるノックアウト・イネ"羊土社. 2 (2003)