神経内分泌系におけるペプチド性情報分子の超高感度定量法の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15657015
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 浦野 明央 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 教授 (00142232)
• Keywords: 神経ホルモン / ペプチド / 神経内分泌系 / 超高感度定量法 / 化学発光 / 競合アッセイ / GnRH

Research Abstract

最先端の形態学的な手法を用いることにより,細胞あるいは細胞内小器官における特定の分子種の局在を明らかにすることが可能であるが,その分子種が,絶対量として,そこにどれだけあるかという情報を得ることは簡単ではない.特定のタンパク質をコードするDNAあるいはRNAの場合には,リアルタイムPCR法を用いることにより,10^<-22>molという感度で,アッセイすることが可能になったが,タンパク質あるいはペプチドのアッセイ感度は放射免疫法(radioimmuno-assay, RIA)でも1-10fmol(fmol=10^<-15>mol)である.そのため,既存の方法では,定量的に解析した遺伝子レベルの現象を,タンパク質レベルさらには細胞レベルの現象と対応させることができない.この問題を解決するためには,ごく微量の特定のタンパク質あるいはペプチドの絶対量を測定する方法を,新たに開発する必要がある.そこで,本研究では,生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)を対象とし,方法の開発の第一段階として,標識ホルモンとしてビオチン化GnRHを用い,競合的な反応の後に,GnRH抗体に結合しているビオチン化GnRHの量を,アビジン酵素(β-Galactosidase,β-Gal)複合体を用い,化学発光により検出することを目指して研究を進めてきた.GnRHは,アミノ酸配列のうちのエピトープとなり得る場所への影響を避けるため,そのN末端をビオチン化したサケ型およびニワトリ型のものを,非標識ホルモンとあわせて合成した.目下,それに続いて,10-100amol(amol=10^<18>mol)の感度を持っており,しかも測定時間が短くてすむアッセイ系を確立するためのβ-Galの蛍光基質をサーベイしつつある.

Research Products

• [Publications] Bhandari, R.Kr.: "Seasonal changes of responses to gonadotropin-releasing hormone analog in expression of growth hormone/prolactin/somatolactin genes in the pituitary of masu salmon."General and Comparative Endocrinology. 130・1. 55-63 (2003)
• [Publications] Onuma, T.: "Changes in expression of genes encoding gonadotropin subunits and growth hormone/prolactin/somatolactin family hormones during final maturation and freshwater adaptation in pre-spawning chum salmon."Endocrine. 20・1-2. 23-33 (2003)
• [Publications] Jodo, A.: "Five different types of GnRH receptor genes are expressed in the brain of masu salmon (Oncorhynchus masou)."Zoological Science. 20. 1117-1125 (2003)
• [Publications] Onuma, T.: "Year-to-year differences in plasma levels of steroid hormones in prespawning chum salmon : influence of sea surface temperature."General and Comparative Endocrinology. 133. 199-215 (2003)
• [Publications] Saito, D.: "Gonadotropin-releasing hormones modulate electrical activity of vasotocin and isotocin neurons in the brain of rainbow trout."Neuroscience Letters. 351. 107-110 (2003)
• [Publications] Saito, D.: "Functional organization of preoptic vasotocin and isotocin neurons in the brain of rainbow trout : central and neurohypophysial projections of single neurons."Neuroscience. (in press). (2004)