ゲノムのピンポイント修飾を目指したDNA配列特異的な官能基転移反応の検討

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659004
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 佐々木 茂貴 九州大学, 薬学研究院, 教授 (10170672)
• Keywords: S-ニトロシル / S,N-転移反応 / N-ニトロシル / 脱アミノ化 / 点変異 / 遺伝子修復 / 官能基転移 / オリゴヌクレオチド

Research Abstract

がん遺伝子の例で示されるようにわずか1個の塩基の変化で、たんぱく質機能が大きく変化する。本研究は、このような塩基変換を引き起こす化学反応を配列および塩基特異的にコントロールできる高機能分子を開発しようとするものである。本研究では、化学的に遺伝子機能を改変する新しい手法の開発を目的とした。
分子設計および合成
6位に官能基を含む2-aminopurine nucleoside誘導体とシトシンとの反応を分子軌道計算で予測し、シトシン4-アミノ基にニトロシル基を転移するヌクレオシドアナログとしてS-ニトロシル-6-チオグアノシンを設計した。まず、チオグアノシンを保護基を用いてDNAに組み込んだ後、SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)と反応させることによりS-ニトロシル体に変換した。
ニトロシル基転移反応の検討
このようにして合成した6-(S-ニトロシル)-置換-2aminopurineを含むDNAと標的位置にシチジン、5-メチルシチジン、アデノシン、グアノシン、チミジンを含む相補的DNAとの反応性を比較したところ、シチジンと5-メチルシチジン特異的に転移反応が速やかに起こることが示された。さらに、シチジンを標的位置からずれた配列に対して転移反応は殆ど起こらず、ニトロシル転移反応が配列および塩基特異的であることが確認された。また、強い求核剤であるチオール基をもつグルタチオンとの反応は1mMの高濃度でも起こらなかったことから、本反応がハイブリダイゼーションによる近接効果によって起こることが示唆された。
点変異誘起能の検討
シチジンあるいは5-メチルシチジンにニトロシル基が転移した標的DNAを酸性条件件下1日 5日放置した後、酵素加水分解を行い、塩基構造の変化を調べたところ、シチジンからはdU(8%)とdC-diazoate^<15>(14%)が得られ、5-メチルシチジンからdT(42%)とd^mC-diazoate(13%)が得られた。この結果から、本反応は配列特異的かつ塩基特異的に塩基変換を起こせる、画期的な方法であることが確認された。

Research Products

• [Publications] Nagatsugi F., Sasaki S., Miller P.S., Seidman M.M.: "Site-Specific Mutagenesis by Triple-Helix Forming Oligonucleotides Containing a Reactive Nucleoside Analogue."Nucleic Acids Res.. 31・6. e31 (2003)
• [Publications] Shigeki Sasaki, Yosuke Taniguchi, Ryo Takahashi, Yusuke Senko, Keiichi Kodama, Fumi Nagatsugi, Minoru Maeda: "Selective Formation of Stable Triplexes Including a TA or a CG Interrupting Site with New Bicyclic Nucleoside Analogs (WNA)"J.Amer.Chem.Soc.. 126(2). 516-528 (2004)
• [Publications] Tanada, Mikimasa, Shibata, Yoshihiro, Maeda, Minoru, Sasaki, Shigeki: "Bipyrrole Derivatives as New DNA-Minor Groove Binders,"Heterocycles. 63(1). 29-39 (2004)
• [Publications] Oishi M, Sasaki S, Nagasaki Y, Kataoka K.: "pH-responsive oligodeoxynucleotide (ODN)-poly(ethylene glycol) conjugate through acid-labile beta-thiopropionate linkage : preparation and polyion complex micelle formation,"Biomacromolecules. 4(5). 1426-1432 (2003)
• [Publications] Hiroshi Tokiwa, Nobuyuki Sera, Kiyoshi Fukuhara, Hideo Utsumi, Shigeki Sasaki, Naoki Miyata: "Structural activity relationship between Salmonella-mutagenicity and nitro-orientation of nitroazaphenanthrenes,"Chemico-Biological Interactions. 146(1). 19-25 (2003)
• [Publications] 佐々木茂貴: "ゲノムケミストリー第2章6,2本鎖DNA形成をトリガーとするシンクロナイゼーション活性化によるクロスリンク反応(関根光雄, 斎藤烈編)"講談社サイエンティフィク. 240(89-100) (2003)