トランスジュニックおよび遺伝子ノックアウト住血吸虫の確立とその応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659102
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 奈良 武司 順天堂大学, 医学部, 講師 (40276473)
• Keywords: 住血吸虫 / 遺伝子導入 / 遺伝子ノックアウト / マイクロインジェクション / 遺伝子銃

Research Abstract

本年度は、マンソン住血吸虫スポロシストへの遺伝子導入に必要な技術基盤の確立を主眼に、1)遺伝子導入に用いる組換えプラスミドDNAの調製、2)スポロシストのin vitro培養と中間宿主貝Biomphalaria glabrataへの移入、および3)遺伝子銃を用いた、組換えプラスミドの試験的導入、について検討した。
1)マンソン住血吸虫のTriose phosphate isomerase (TPI)遺伝子の5'上流および3'下流の非翻訳領域(UTR)をPCRで増幅し、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子を挟み込んだプラスミド(pTPI:GFP)を作製した。また、マンソン住血吸虫のゲノムライブラリーよりパラミオシン遺伝子を単離し、5'および3'UTRの塩基配列を決定後、5'および3'UTRでGFP遺伝子を挟み込んだ組換えプラスミド(pPMY:GFP)を作製した。
2)マンソン住血吸虫ミラシジウムをスポロシスト転換培地に移し、スポロシストに転換させた後、B. glabrata由来のBge細胞の非存在下で単独培養を行なった。この方法により運動性を持つスポロシストを1週間以上培養することができた。セルカリアへの発育はB. glabrata体内の方が勝るので、B. glabrataの軟体部および中腸を切開し、貝一匹あたり10隻の培養スポロシストを移入した。その結果、中腸部に移入した貝の約30%でセルカリアの形成が認められた。軟体部への移入では貝の死亡率が高く(70%以上)、約10%の貝でセルカリアが認められたのみだった。
3)1)で作製した組換えプラスミドを直鎖状にし、遺伝子銃(BIO-RAD製、PDS-1000)を用いてスポロシストへの導入を行ない、蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡を用いてGFPの発現を検討した。文献的にはpTPI:GFPの導入によりGFPの蛍光が観察されたとあるが、本研究では蛍光は観察されず、またスポロシストは強い自家蛍光を持つことが明らかとなった。
以上の結果を踏まえ、次年度は他のレポーター遺伝子を検討するとともに、導入遺伝子の転写レベルの検出、およびマイクロインジェクションによる遺伝子導入について検討する。

Research Products

• [Publications] 飯泉恭一, 奈良武司, 大前比呂思, 青木孝: "マンソン住血吸虫への遺伝子導入法開発の試み"第72回日本寄生虫学会大会&日本住血吸虫発見100年記念国際シンポジウムプログラム・抄録集. 86 (2003)