リボザイムライブラリーを使用したヒトGH遺伝子LCR関連蛋白の同定とその機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659221
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 千原 和夫 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (00107955)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井口 元三 神戸大学, 医学部附属病院, 助手 (60346260) ; 置村 康彦 神戸大学, 医学部, 助教授 (30204100)
• Keywords: 成長ホルモン / 下垂体 / locus control region / 遺伝子クローニング / リボザイムライブラリー / iRNAライブラリー

Research Abstract

最近、GH遺伝子の上流約14.5kbにGH遺伝子発現を規定するlocus control region (LCR)があり、このLCRが生理的なGH発現を調節する重要な領域であることがわかってきた。このLCRに作用して、機能を制御するタンパクを同定することを目的に下記の実験を行なった。
ヒトGHLCRの下流にGH遺伝子プロモーター、さらにその下流にGFPcDNAを結合した発現ベクターを構築した。この順番が保たれるよう、このベクターを直線化し、GH3細胞(下垂体GH、PRL産生細胞)にトランスフェクションしGFPが産生されることを確認した。組み込まれたゲノム領域の外来性遺伝子発現に及ぼす影響は、LCRがあると出現しにくいことが報告されており、このGFP陽性細胞では、ゲノムに組み込まれた外来遺伝子由来のGH遺伝子LCRとプロモーターによってGFP発現がおこっていることが期待される。一方、Cos細胞(線維芽細胞、コントロールとして使用)にトランスフェクションしたところ、GFPの産生は認められなかった。現在、GFP陽性GH3細胞のセルソーターによる単離を行なっている。今後、GFP陽性細胞に対して、リボザイムライブラリーをトランスフェクトした後、セルソーターによりGFP陽性細胞と陰性細胞の分離を行ない、新たに出現したGFP陰性細胞を単離、それに含まれるプラスミド回収し、それが標的としたmRNA配列を同定する予定である。また、リボザイムライブラリー以外に、iRNAライブラリーをも使用することも計画している。

Research Products

• [Publications] Yoshioka S: "Up-regulation of mitochondrial transcription factor1 mRNA levels by GH in VSMC"Life Sci. 74. 97-109 (2004)
• [Publications] Iida K: "Diverse regulation of full-length and truncated growth hormone receptor expression in 3T3-L1 adipocytes"Mol Cell Endocrinol. 210. 21-29 (2003)
• [Publications] Fumoto M: "Cloning of a protein binding to the most proximal Pit-1 binding element of prolactin gene from human pituitary cDNA library"Mol cell Endocrinol. 207. 31-38 (2003)
• [Publications] Sakatani T: "Lactogenic hormone responsive element reporter gene activation assay for human growth hormone"Growth Horm IGF Res. 13. 275-281 (2003)
• [Publications] Kishimoto M: "Cloning and characterization of the 5'-flanklng region of the human ghrelin gene."Biochemical and Biophysical Research Communications. 305. 186-192 (2003)
• [Publications] Kishimoto M: "Mutant form of Pit-1 (R271W) does not act as a dominant inhibitor of Pit-1 action to activate the promoters of growth hormone and prolactin genes"Euro J Endocrinol. 148. 619-625 (2003)
• [Publications] Murata M: "A study of carotid intima-media thickness in GH-deficient Japanese adults during onset among adults and children"Euro J Endocrinol. 148. 333-338 (2003)
• [Publications] Okimura Y: "The role of circulating ghrelin in growth hormone (GH) secretion in freely-moving rats"Life Sci. 72. 2517-2524 (2003)