ヒト歯根膜DNAチップを用いた根尖性歯周炎の遺伝子病態解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659454
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 北村 正博 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (10243247)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池澤 一彦 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (80294114) ; 島袋 善夫 大阪大学, 大学院・歯学研究科, 助教授 (50231361) ; 村上 伸也 大阪大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (70239490) ; 山田 聡 大阪大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (40359849) ; 野崎 剛徳 大阪大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (30263304)
• Keywords: DNAマイクロアレイ / 根尖性歯周炎 / 歯根膜細胞 / 炎症性サイトカイン

Research Abstract

1)ヒト歯根膜DNAチップの作製
当研究室において単離・同定して冷凍保存されているヒト歯根膜組織3'末端cDNAライブラリの遺伝子クローン約1500個を、pUC119ライブラリベクター特異的プライマーを用いたPCR法にて遺伝子増幅を行った。そして、これらPCR増幅cDNAをマイクロアレイポッターにて、ガラススライド上に高密度固定し、ヒト歯根膜組織由来の約1500個の遺伝子が固定化されたヒト歯根膜DNAチップ(PerioGen Chip)を作製した。
2)in vitro根尖性歯周炎モデルでの遺伝子発現解析
培養ヒト歯根膜細胞の培養系に炎症性サイトカインを添加し、歯根膜細胞を刺激した際の経時的な遺伝子発現変化をPerioGen Chipを用いて解析した。ヒト歯根膜細胞をIL-1あるいはTNF-αで48時間刺激し、細胞を回収しRNAを抽出した。サンプルRNAをCy3蛍光色素にて、無刺激の歯根膜細胞からのRNAをCy5蛍光色素にて逆転写反応時に標識した。これら標識試料をPerioGen Chipにハイブリダイズした。余剰の標識試料を洗浄除去した後、アレイディテクターにてPerioGen Chipの各遺伝子スポットの発光強度を検出し、コンピュータ解析した。その結果、炎症性サイトカイン刺激でその発現量が上昇あるいは下降する遺伝子群が同定された。現在、これら変化を示した遺伝子群の解析を進めている。