DNAチップを用いた口腔微生物叢の網羅的定量的プロファイリング

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15659500
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 高橋 信博 東北大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (60183852)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 拓一 東北大学, 大学院・歯学研究科, 講師 (10303132) ; 竹原 直道 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (00038879) ; 小関 健由 東北大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (80291128)
• Keywords: DNAチップ / 16S ribosomal RNA / DNAプローブ / DNAプライヤー / 口腔細菌 / 培養法 / PCR-RFLP法 / 菌種特異的PCR法

Research Abstract

本年度は、1.DNAチップの基本となる口腔細菌特異的プローブの設計および作成、2.口腔試料を用いて、DNAチップ用プローブと既存のPCRプライマーの比較検討、従来法による口腔細菌叢の解析を行い、試料の一部は将来のDNAチップ解析用試料として保存した。
1.歯垢細菌特異的プローブの設計および作成
(1)プローブの設計
口腔細菌叢構成細菌の内、約30菌種の16S ribosomal RNA塩基配列(GenBankより)をもとに、DNAチップ用の細菌特異的プローブ(オリゴDNA)を設計した。
(2)プローブの作成
(1)の設計をもとに、DNAチップ作成共同研究企業へプローブの作成の検討を依頼した。DNAチップへの搭載の可否を現在検討中である。
2.従来法による歯垢細菌叢の解析
(1)口腔試料の採取
う蝕病巣、歯周病巣からのプラーク試料を口腔試料として採取し、一部は、将来のDNAチップ解析用試料として凍結保存した。試料の採取は、学内倫理委員会規程に則って行った。
(2)菌種特異的PCR法による菌種の検索
(1)の試料を用いて、ミュータンスレンサ球菌などの病原微生物を、既存のプライマーおよびDNAチップ用プローブの塩基配列を持つプライマーを用いて検出し、その感度や特性を比較した。両者には大きな違いはなかった。
(3)培養法による菌種の検索
試料を通法にて血液寒天平板で培養し、コロニー数から細菌叢全数を求め、各コロニーの微生物種をPCR-RFLP解析から同定した。この結果は、将来得られるDNAチップ解析結果と比較検討を行う予定である。

Research Products

• [Publications] Nobuhiro Takahashi: "Acid-neutralizing activity during amino acid fermentation by Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Fusobacterium nucleatum."Oral Microbiology and Immunology. 18(2). 109-113 (2003)
• [Publications] Takuichi Sato: "Nested PCR for detection of mutans streptococci in dental plaque."Letters in Applied Microbiology. 37(1). 66-69 (2003)
• [Publications] Takuichi Sato: "Identification of mutans streptococci by restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction-amplified 16S ribosomal RNA genes."Oral Microbiology and Immunology. 18(5). 323-326 (2003)
• [Publications] Shoko Takahashi-Abbe: "Biochemical and functional properties of pyruvate formate-lyase (PFL)-activating system in Streptococcus mutans."Oral Microbiology and Immunology. 18(5). 293-297 (2003)
• [Publications] Harumi Miyasawa: "Xylitol inhibition on anaerobic acid production by Streptococcus mutans at various pH levels."Oral Microbiology and Immunology. 18(4). 215-219 (2003)
• [Publications] Junko Matsuyama: "Fermentation of five sucrose isomers by human dental plaque bacteria."Caries Research. 37(6). 410-415 (2003)
• [Publications] Hatsue Kakuta: "Xylitol inhibition on acid-production and growth of mutans streptococci in the presence_of_various_dietary_sugars under strictly anaerobic conditions."Caries Research. 37(6). 404-409 (2003)
• [Publications] Kazuo Kato: "A method for mapping the distribution pattern of cariogenic streptococci within dental plaque in vivo."Caries Research. 38(in press). (2004)
• [Publications] Kousuke Ohki: "PTC gene mutation and expression of SHH, PTC, SMO, and GLI-1 in odontogenic keratocysts."International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 33(in press). (2004)
• [Publications] Hiroyuki Tada: "Proteolysis of ICAM-1 on human oral epithelial cells by cysteine proteinases (Gingipains) from Porphyromonas gingivalis leading to down-regulation of neutrophil adhesion."Journal of Dental Research. 82. B-41 (2003)
• [Publications] Takuichi Sato: "Combination of genus-specific PCR and RFLP analysis for identification of oral streptococci."Journal of Dental Research. 82. B-80 (2003)
• [Publications] Gen Mayanagi: "Detection of 25 periodontopathic bacteria from periodontal sites by nested PCR."Journal of Dental Research. 82. B-153 (2003)
• [Publications] Mitsuru Shimonishi: "Expression of type IV collagen and laminin in the interface between epithelial cells and fibroblasts from human periodontal ligament."Journal of Dental Research. 82. B-287 (2003)
• [Publications] Nobuhiro Takahashi: "Metabolic pathway for palatinose of oral Actinomyces species."Journal of Dental Research. 82. B-360 (2003)
• [Publications] Kazuo Kato: "Distribution profiles of cariogenic streptococci within dental plaque treated with stannous fluoride gel."Caries Research. 37(4). 267-268 (2003)
• [Publications] Jumpei Washio: "Hydrogen sulfide-producing bacreria in tongue coating and oral malodor."Journal of Dental Research. 83(in press). (2004)
• [Publications] Mitsuru Shimonishi: "Expression of amelogenin in cultired epithelial rests of Malassez."Journal of Dental Research. 83(in press). (2004)
• [Publications] Juta Sato: "Expression of non-collagenous bone proteins at epithelial cell-fibroblast interface."Journal of Dental Research. 83(in press). (2004)
• [Publications] 熊谷 崇: "歯垢中のmutans streptococciのPCR法による検出について"東北大学歯学雑誌. 22(1). 54 (2003)
• [Publications] 多田浩之: "Porphyromonas gingivalisジンジパインはヒト菌肉線維芽細胞CD14を分解してLPS不応答性を誘導する"日本細菌学雑誌. 58(1). 158 (2003)
• [Publications] 佐藤廉也: "矯正用アンカープレート周囲溝内の細菌叢のプロファイリング"歯科基礎医学会雑誌. 45(5). 271 (2003)
• [Publications] 佐藤拓一: "菌属特異的なPCRとRFLP解析による口腔レンサ球菌種の同定"歯科基礎医学会雑誌. 45(5). 271 (2003)
• [Publications] 大島勇人: "抗菌性薬剤に対するラット臼歯感染歯髄の反応"歯科基礎医学会雑誌. 45(5). 287 (2003)
• [Publications] 阿部昌子: "ミュータンスレンサ球菌乳酸脱水素酵素の活性調節に対する環境pHの影響"歯科基礎医学会雑誌. 45(5). 325 (2003)
• [Publications] 角田初恵: "キシリトールによるStreptococcus mutans増殖抑制効果"歯科基礎医学会雑誌. 45(5). 326 (2003)
• [Publications] 堀はるみ: "Streptococcus mutans酸産生能のキシリトール感受性の多様性とその生化学的機構"歯科基礎医学会雑誌. 45(5). 326 (2003)
• [Publications] 加藤一夫: "real-time定量PCRを利用した歯垢内細菌の層別密度分布の分析"口腔衛生学会雑誌. 53(4). 340 (2003)
• [Publications] 鷲尾純平: "口臭と舌苔中の総菌数および硫化水素産生菌数との関係"口腔衛生学会雑誌. 53(4). 344 (2003)
• [Publications] 五十嵐公英: "小児から高齢者に至る広範囲年齢層プラーク酸産生能のチェアーサイドでの評価"口腔衛生学会雑誌. 53(4). 381 (2003)