光機能性生体分子によるアポトーシスの誘導と癌治療への応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15710161
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 遠藤 政幸 大阪大学, 大学院・産業科学研究所, 助手 (70335389)
• Keywords: アポトーシス / カスパーゼ-3 / 光化学 / 非天然アミノ酸 / 細胞外翻訳反応 / 細胞導入 / 癌治療

Research Abstract

ヒト由来のcaspase-3は細胞内で前駆体として不活性な状態で存在するが、アポトーシスシグナル伝達の上流にあるプロテアーゼであるcaspase-8による特異的な切断で活性のある4量体が形成される。caspase-3への特異的な切断を光反応で行うため、ペプチド鎖を解裂させる光反応性アミノ酸2-nitrophenylglycine(Npg)を特異的な切断位置(セリン176番目)に導入した。光反応性のcaspase-3の合成法は、光反応性アミノ酸Npgと核酸2量体pdCpAを有機合成し、それらをカップリンさせることでpdCpA-Npgを合成した。次にアミノアシルーtRNA (Npg-tRNA)を合成した。Caspase-3遺伝子の176番目のコドンを4塩基コドンに変異し、Npg-tRNAを添加して細胞外翻訳反応を行うことで、光反応性caspase-3の合成に成功した。光照射は高圧水銀ランプ(500W)にモノクロメーターを使用し、365nmの光によって行った。Npg単体では光照射によって速やかに分解される。合成した光機能性caspaser-3に光照射したところ、照射時間に伴って分解消失した。光照射後のcaspase-3が酵素活性を回復したか見るため、蛍光性分子を結合した特異的なペプチドDEVD (Asp-Glu-Val-Asp)を基質として反応性をみた。その結果、0℃で光照射わずか1分間で酵素活性を回復し、以降の光照射時間では酵素活性の増加は見られなかった。つまり、短時間でほぼ活性を回復できたことになる。また、caspase-3の阻害剤であるDEVD-CHOを光照射後、同じタンパクに添加すると活性が完全に抑えられたことから、DEVDの切断はcaspase-3の活性によるものであることが確かめられた。このことから、光反応性caspase-3は光照射とペプチド鎖の切断とそれに伴う活性なcaspase-3複合体が形成され、Npgによる修飾は活性に影響を与えないことが明らかとなった。また、Npgの導入でcaspase-8の認識配列でなくなるため、細胞中で上流からのシグナル伝達に反応せず、光照射のみで活性化を行うことができる。この結果、細胞内への光機能性caspase-3が導入されれば、アポトーシスの誘導が可能性となると考えられる。現在、これらの光機能化したcaspase-3を細胞に侵入可能なHIV(ヒト免疫不全ウィルス)のTAT配列(YGRKKRRQRRR)のペプチドに結合し、ヒトのT細胞(Jurkat T cell)内に効率よく取り込ませる実験に移行する段階である。

Research Products

• [Publications] M.Endo, T.Majima: "Control of A Double Helix DNA Assembly by Use of Cross-Linked Oligonucleotides"Journal of The American Chemical Society. 125. 13654-13655 (2003)
• [Publications] M.Endo, T.Majima: "Parallel, Double-Helix DNA Nanostructures Using Interstrand Cross-Linked Oligonucleotides with Bismaleimide Linkers"Angewante Chemie International Edition. 42. 5744-5747 (2003)
• [Publications] M.Endo, K.Nakayama, Y.Kaida, T.Majima: "Photoisomerization of 2'-deoxyribofranosyl and ribofuranosyl 2-phenylazoimidazole"Tetrahedron Letters. 44. 6903-6906 (2003)
• [Publications] M.Endo, K.Nakayama, T.Majima: "Design and Synthesis of Photochemically Cont5rollable Restriction Endonuclease BamHI by Manipulating the Salt-Bridge Network in the Dimer Interface"Journal of Organic Chemistry. 69(in press). (2004)
• [Publications] M.Kimoto, M.Endo, T.Mitsui, T.Okuni, I.Hirao, S.Yokoyama: "Site-specific Incorporation of a Photo-crosslinking Component into RNA by T7 Transcription Mediated by Unnatural Base Pairs"Chemistry & Biology. 11. 47-55 (2004)
• [Publications] M.Endo, T.Mitsui, T.Okuni, M.Kimoto, I.Hirao, S.Yokoyama: "Unnatural Base Pairs Mediate the Site-Specific Incorporation of an Unnatural Hydrophobic Component into RNA Transcripts"Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 14(in press). (2004)