出芽酵母をモデル系とした抗癌剤ストレスのプロテローム解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15750150
• Research Institution: Kobe City College of Technology
• Principal Investigator: 芝崎 誠司 神戸市立工業高等専門学校, 応用化学科, 講師 (50342530)
• Keywords: 5-FU / 遺伝子ライブラリー / 出芽酵母

Research Abstract

抗癌薬5-FUストレス応答の細胞内メカニズムを、出芽酵母モデル系を用いたプロテオーム解析により解明するにあたり、宿主細胞の5-FU閾値の調査、ゲノム遺伝子ライブラリーの作成、5-FU耐性株の取得を進行中である。
1 5-FUの閾値について
出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeのYPD培地における5-FU阻害効果として、400μg/mlの濃度で生育が完全に阻害されるとの報告を参考に、本研究では宿主として用いるW303-1A株の閾値について調査した。本株は400μg/mlの5-FU濃度においては微少ではあるが生育が確認され、既に報告されている文献とは若干異なる結果が得られた。耐性株のスクリーニングにおいては、ここで得られた閾値を基準にした。
2 ゲノムライブラリーの作製
S.cerevisiae W303-1A株のゲノム遺伝子を抽出、精製し、6-10kbpのDNA断片が得られるようにSau3 AIで消化した。このDNA断片をpRS406mプラスミドベクターのBamHIサイトに導入し、ライブラリーの作製を試みたが、挿入断片の長さに偏りがみられた。そこで、YEp13プラスミドベクターを用いるとともに、形質転換、ライゲーション等の実験条件について再検討を加えた。YEp13の場合でライブラリーとして利用できる遺伝子集団が得られたため、これを用いて5-FU耐性株の取得を進めることにした。
3 5-FU耐性株の取得
上記で作製したゲノムライブラリーを酢酸リチウム法を用いてW303-1A株に導入した。選択培地(SD-Leu培地)上で形質転換体を得、レプリカにより複数の異なる5-FU濃度を含むYPD培地に移し採り、5-FU耐性株の取得を行っている。