連続複数塩基ランダム置換法の開発とホスホリパーゼDの機能改変への応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15760586
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 岩崎 雄吾 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 講師 (50273214)
• Keywords: ランダム変異 / PCR / ホスホリパーゼD / 機能改変

Research Abstract

連続複数塩基ランダム置換法(RARE-COMBI法)の検討
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をモデル鋳型とし、3'末端近傍にミスマッチを有する合成DNAをプライマーとした相補鎖合成をPCR法で検討したところ、(1)DNAポリメラーゼは校正活性の低いものを用いる、(2)反応サイクル数を通常のPCRより長く(50サイクル)設定する、(3)25サイクル終了後にポリメラーゼを再添加する。という三つの条件を満足すれば、ミスマッチプライマーでも通常のプライマーと同様の増幅率が得られ,かつ意図したとおりの変異が導入できることを確認した。また、ミスマッチプライマーとミスマッチの無い完全アニール型プライマーを混合して競合的にPCRを行っても,そのプライマーの投入比の通りに変異DNAが出現することを確認した。今後は、ターゲット遺伝子を対象に、RARE-COMBI法を実施し,それを完成させる。
ホスホリパーゼD(PLD)の変異ライブラリの構築
RARE-COMBI法が未完成であったため、PLD遺伝子のコンビナトリアルライブラリを構築した。また、合成基質を考案しそれを利用した簡便なハイスループット検出法を確立した(論文発表済み)。実際にこの検出法を用いて野生型酵素では本来活性を示さない人工リン脂質であるホスファチジル-1-ナフトールに対してスクリーニングを行ったところ、それを分解する能力を獲得した変異型PLDを取得することに成功した。今後はRARE-COMBI法の完成を待って、本酵素のさらなる機能改変を行う。

Research Products

• [Publications] Iwasaki Y., Nishikawa S., Tsuneda M., Takahashi T., Yamane T.: "Detection of phospholipase D on solid materials"Analytical Biochemistry. (in press). (2004)