染色体の再構成とナノ構造解析による染色体折りたたみ分子機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15770066
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 吉村 成弘 京都大学, 生命科学研究科, 助教授 (90346106)
• Keywords: 染色体 / クロマチン / 核内マトリクス / 原子間力顕微鏡

Research Abstract

発現ライブラリのスクリーニングによるモノクローナル抗体の抗原決定
・染色体より抽出したタンパク質を抗原としてハイブリドーマを作成し、54種190個のクローンを得た。
・54種のうち、22個は核内の構造物を、11個は細胞骨格、7個は紡錘体、14個はその他の細胞内器官を認識した。
・発現ライブラリのスクリーニングにより、10種類のハイブリドーマに関して抗原を決定した。
・モノクローナル抗体(#04A)の抗原として同定された新規タンパク質は、641アミノ酸から構成され、中央部にJmjCドメイン、N末端近傍に核局在シグナル(NLS)を持つものであった。
・このタンパク質にタグを付加してHeLa細胞で発現させると、核小体への局在が確認された。
試験管内での高次クロマチンファイバーの再構成
3kbから100kbまで長さの異なるプラスミドDNA(環状スーパーコイル状態)を調整し、これらを用いて塩透析法でクロマチンファイバーを再構成した。これを原子間力顕微鏡を用いて観察・解析し、次のような成果を得た
・用いたDNAが長いほど、高い密度でヌクレオソームが形成される。
・この相関関係は、負にスーパーコイルした環状プラスミドにのみみられ、直鎖状DNAや、弛緩型環状プラスミドではみられなかった。
・リンカーヒストンH1を加えると、クロマチンがさらに折りたたまれて、より太いファイバー状の構造を形成される。
ハイブリッドイメージング技法の確立
AFM像中に、特定のタンパク質の所在をプロットするために、AFMと蛍光顕微鏡とを組み合わせたシステムを構築した。GFPを融合させたPMLタンパク質(核内マトリクスに局在)をガラス基板上で培養したHeLa細胞内に発現させ、その基板上で核マトリクスを精製したのちこれを蛍光顕微鏡とAFMとで観察した結果、PMLタンパク質が局在する部位(PMLボディー)の微細構造をAFMで観察することに成功した。

Research Products

• [Publications] Shige H.Yoshimura: "On-substrate lysis treatment combined with the scanning probe microscopy revealed chromosome structures in eukaryotes and prokaryotes."J.Electr.Microsc.. 52・4. 415-423 (2003)
• [Publications] Shige H.Yoshimura: "Chromatin reconstitution : development of a salt-dialysis method monitored by nano-technology."Arch.Histol.Cytol.. 65・5. 405-413 (2003)
• [Publications] Shige H.Yoshimura: "Molecular mechanism of DNA and-loop formation by TRF2"Genes to Cells. 9・3. 205-218 (2004)
• [Publications] Shige H.Yoshimura: "Fundamental structural units of the Escherichia coli nucleoid revealed by nano-technology."Nuc.Acids Res.. In press. (2004)
• [Publications] Shige H.Yoshimura: "Atomic force microscopy demonstrates a critical role of DNA superhelicity in the nucleosome dynamics."Cell Biochem.Biophys.. In press. (2004)
• [Publications] 吉村成弘: "生化学と形態学の融合〜DNAとタンパク質のイメージング"電子顕微鏡. 38・2. 74-77 (2003)