ラディキシンFERMドメインと三量体Gタンパク質αサブユニットの複合体結晶解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15770068
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 北野 健 奈良先端科学技術大学院大学, 情報科学研究科, 助手 (40346309)
• Keywords: タンパク質 / X線結晶構造解析 / ラディキシン / FERMドメイン / 三量体Gタンパク質

Research Abstract

ラディキシンは,ERM(ezrin/radixin/moesin)タンパク質のひとつである。本研究は,ラディキシンのFERMドメインと,三量体Gタンパク質αサブユニットの複合体を調製・共結晶化し,X線結晶構造解析によりその複合体構造を決定することを目的としている。
まず,結晶化に必要なタンパク質サンプルを得るために,FERMドメインと,Gαサブユニットを大量に精製するための実験をおこなった。FERMドメインについては,大腸菌による大量発現法とクロマトグラフィーによる精製法を用いることによって,数十mgのタンパク質を調製することができた。Gαサブユニットについては,大腸菌内で大量発現させた場合,グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質の状態で,少量を水溶性画分に回収することができたが,GSTタグを切断し,Gαサブユニットのみの状態にすると,著しく凝集・沈殿してしまうことが分かった。このタンパク質の不安定性の問題を解決すべく,界面活性剤の利用,GSTタグの切断条件,ヒスチジンタグの利用など、種々の条件の検討をおこなったが,いずれの手法によっても,結晶化に必要な高純度,かつ充分量のタンパク質を精製することはできないことが分かった。
よって,Gαサブユニットを,単体でなく,FERMドメインと複合体形成させることによって安定化した状態で精製するために,これらのタンパク質の共発現用プラスミドの作成をおこなった。また,GαサブユニットのFERM結合サイトを同定し,今後のコンストラクト作成に応用するため,表面プラズモン共鳴センサー(BIAcore)による分子間結合実験をおこなった。