リン酸化プロテオミクスを用いた新規血管新生因子の同定

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15790118
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 岸 博子 山口大学, 医学部, 講師 (40359899)
• Keywords: 血管平滑筋 / プロテオミクス / スフィンゴ脂質 / チロシンリン酸化 / MALDI-TOF-MS / MS / LC-MS / MS / 細胞遊走 / 質量分析

Research Abstract

1.研究の背景および目的
血管平滑筋細胞遊走は、血行障害による傷害臓器再生のための機能的な血管新生において重要な役割を果たす。申請者は過去に平滑筋ミオシン軽鎖リン酸化酵素(MLCK)が血管平滑筋細胞遊走を制御する事を発見した実績を持つ。申請者の教室で血管平滑筋の異常収縮のシグナル分子として発見されたスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)は血管平滑筋細胞遊走も引き起こす事が近年報告されている。本研究はリン酸化プロテオミクスの手法を用いてSPCおよびMLCKによる血管平滑筋細胞遊走のシグナル伝達の全容を明らかにし、臓器再生のための血管新生の新たな治療法の標的分子を見出す事を目的とするものである。
2.本年度の研究実績
(1)方法1)ヒト冠状動脈平滑筋細胞(CASMCs)をSPCで刺激し、チロシンリン酸化される蛋白質を抗リン酸化チロシン抗体RC20によるウェスタンブロット法でスクリーニングした。2)これらの蛋白をRC20による免疫沈降法で抽出し、SDS-PAGEにて分離後、PVDF膜に転写してクマシーブリリアントブルーで染色して蛋白バンドを切り出し、PVDF膜上で蛋白の還元-Sアルキル化処理を行ったのち、プロテアーゼ(Achromobacter Protease I)で消化した。上記の方法は、従来知られているゲルを銀染色した後にトリプシンで蛋白をゲル内消化する方法より、消化効率が優れていた。3)消化ペプチドをZipChipC18で脱塩後、タンデム型質量分析計(MALDI-TOF-MS/MS,LC-MS/MS)を用いペプチドマスフィンガープリントを行いゲノム情報に基づき分子を同定した。(2)結果1)RC20によるクエスタンブロットにより、SPC(30μM)刺激5分後にチロシンリン酸化される蛋白が認められ、p40と命名した。2)p40をタンデム型質量分析計で同定した結果、phospholipid-binding Protein, G-proteinと相互作用する蛋白、および機能未知の蛋白分子が候補として挙げられた。

Research Products

• [Publications] 岸 博子: "エイコサペンタエン酸(EPA)による血管攣縮の予防効果"月刊バイオインダストリー. 20. 5-13 (2003)
• [Publications] Hiroko Kishi: "Sphingosylphosphorylcholine (SPC) and Src family tyrosine kinase are novel upstream messengers for Rho-kinase-mediated Ca^<2+> sensitization in vascular smooth muscle contraction"The Japanese Journal of Physiology. 53. S161 (2003)
• [Publications] Hiroko Kishi: "A proteomic approach to identify novel signaling molecules mediating Ca^<2+> sensitization of vascular smooth muscle contraction"Circulation Journal. 68(Suppl.I). 419 (2004)
• [Publications] Kazuyo Takeda: "Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis."Circulation Research. 93(4). 330-337 (2003)