リン酸化酵素PDK1による活性調節がPKCの神経系での機能発揮に及ぼす役割の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15790135
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 関 貴弘 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (50335650)
• Keywords: PKC / PDK1 / リン酸化 / トランスロケーション / アポトーシス

Research Abstract

PDK1はPKCのactivation loopをリン酸化し、PKCを成熟させる酵素である。このPDK1によるリン酸化が抑制されるとPKCターゲティング機構にどのような影響が現れるかを検討するため、δ-PKCのactivation loop付近の配列(δAL)とPDK1に高親和性に結合する配列(PIF)を組み合わせたペプチド断片、δALPIFをコードするcDNAを作製し、これを蛍光タンパク質GFPあるいはDsRed2との融合タンパク質として培養細胞株に発現させた。発現したδALPIFはリン酸化を受けており、これ自身がPDK1の基質として働くことが確認された。続いて、δALPIFをγ-あるいはδ-PKC-GFPと共発現させ、PKC activation loopのリン酸化量を検討したところ、γ-,δ-PKC-GFPのactivation loopのリン酸化はδALPIFにより有意に抑制された。続いてCHO細胞においてγ-,δ-PKC-GFPとδALPIF-DsRed2を共発現させ、ATPによるP2Y受容体刺激を与えたところ、δALPIF-DsRed2が発現している細胞でもγ-およびδ-PKC-GFPは単独発現時と同様に細胞質から細胞膜へのトランスロケーションを示した。γ-およびδ-PKC-GFPの単独発現時では刺激後1-2分で再び細胞質へ戻る(リトランスロケーション)が、δALPIF-DsRed2と共発現した細胞では、2分以上も細胞膜に留まっており、リトランスロケーションの起こる時間が有意に遅くなっていた。よって、δALPIFによるPKC activation loopのリン酸化の抑制はPKCのリトランスロケーションに重要な役割を果たしているということが明らかとなった。また、δALPIFを培養細胞に発現させるとその細胞で有意にアポトーシスが引き起こされ、PKC activation loopのリン酸化の抑制がアポトーシス誘発にも関与することが示唆された。

Research Products

• [Publications] Seki, T., Matsubayashi, H., Amano, T., Kitada, K., Serikawa, T., Sasa, M., Sakai, N.: "Adenoviral gene transfer of aspartoacylase ameliorates tonic convulsions of spontaneous epileptic rats."Neurochemistry International. (in press).
• [Publications] Matsubayashi, H., Amano, T., Seki, T., Sasa, M., Sakai, N.: "Local and endogenous synaptic transmissions mediated via nicotinic alpha4beta2 and alpha7 type postsynaptic acetylcholine receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra."Brain Research. (in press).
• [Publications] Matsubayashi, H., Amano, T., Seki, T., Sasa, M., Sakai, N.: "Electrophysiological characterization of nicotine-induced excitation of dopaminergic neurons in the rat substantia nigra."Journal of Pharmacological Sciences. 93. 143-148 (2003)
• [Publications] Amano, T., Matsubayashi, H., Seki, T., Sasa, M., Sakai, N.: "Repeated administration of methamphetamine causes hypersensitivity of D2 receptor in rat ventral tegmental area."Neuroscience Letters. 347. 89-92 (2003)
• [Publications] Shiwa, T., Amano, T., Matsubayashi, H., Seki, T., Sasa, M., Sakai, N.: "Perospirone, a novel antipsychotic agent, hyperpolarizes rat dorsal raphe neurons via 5-HT_<1A> receptor."Journal of Pharmacological Sciences. 93. 114-117 (2003)